Inmunotinción de secciones transversales de retina.

Para la observación de las capas celulares de la retina, así como de las células que las componen, el protocolo a seguir de inmunotinción fue con Brn3a, PKCα y DAPI, sobre secciones transversales de retina. Tras los pasos previos comunes a la inmunotinción, se procedió a la crioprotección del globo ocular mediante soluciones de sacarosa crecientes. El agua que contienen los tejidos, cristaliza al congelarse

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pudiendo rasgar las muestras, para evitar esto la crioprotección se lleva a cabo mediante baños seriados en diferentes concentraciones de sacarosa. Las concentraciones utilizadas fueron 20, 30, 40% de sacarosa diluida en PBS 0,1M, durante una hora para las dos primeras concentraciones a temperatura ambiente y en agitación continua. El último paso consistió en la inmersión del tejido en sacarosa al 40% durante toda la noche en agitación y a una temperatura de 4ºC.

Una vez realizada la crioprotección los ojos fueron incluidos en un medio adecuado

para la congelación (Optimal Cutting Temperature media, Sakura Finetek, CA

90501, EEUU) donde se mantuvieron durante una hora en volteador y a temperatura ambiente. Posteriormente, fueron colocados en moldes de plástico para congelación con OCT y se procedió a su congelación siendo almacenados a -80ºC hasta su procesamiento.

Se realizaron cortes sagitales dejando secciones de retina de 15 µm de espesor,

mediante el criostato (Bright OTF Cryostat, Bright Instrument Company LTD;

Huntington, Reino Unido). Los cortes eran montados sobre portaobjetos de vidrio

que habían sido previamente gelatinizados y que se conservaron a -20ºC hasta su utilización.

Para proceder a la inmunotinción de las secciones de retina, se siguieron los procedimientos que se describen a continuación durante los dos días siguientes

Día 1:

 Aclimatación: Los cortes son retirados del congelador y mantenidos durante

una hora a temperatura ambiente.

 Lavado: Para eliminar el exceso de OCT y optimizar el efecto de los

anticuerpos, los cortes de retina fueron sometidos a tres lavados de 10 minutos con PBS 0,1M en agitación.

 Preincubación: Con el fin de bloquear señales inespecíficas, las secciones se

sumergieron en una dilución de Tritón X-100 al 0,2% en suero de mono al 2% y PBS 0,1M durante 1 hora en cámara húmeda.

 Incubación con anticuerpos primarios: las secciones fueron incubadas con

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Tritón X-100 al 0,2%, suero de mono al 2% y PBS 0,1M durante toda una noche (aproximadamente 16 horas) a temperatura ambiente y en la cámara húmeda.

Día 2:

 Lavado: Al día siguiente se retiró el exceso de anticuerpo primario con tres

lavados en PBS 0,1M de 10 minutos cada uno y en agitación.

 Incubación con anticuerpo secundarios: Igualmente que, con los primarios,

los anticuerpos secundarios (Cy2 donkey antigoat y Cy3 donkey antirabbit)

se diluyeron en Tritón X-100 al 0,2%, suero de mono al 2% y PBS 0,1M.

 Lavado: Nuevamente se realizaron tres veces por diez minutos en PBS con

agitación para retirar el exceso de los segundos anticuerpos.

 Contraste: Usamos marcadores intercaladores de ADN para determinar las

capas nucleares de la retina. De esta forma, tenemos referencia de la localización de los marcajes en la retina. Para ello, se empleó la molécula 4ˊ,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) a una dilución de 1:1000. Los portaobjetos se mantienen con este marcador nuclear durante diez minutos.

 Lavado: Nuevamente tres veces por diez minutos en PBS en agitación.

 Montaje y lacado: Para el montaje se utilizó un medio adecuado con

propiedad de protección de la fluorescencia, Fluorsave Reagents (Bionova,

Calviochem).

En la Figura 20 se muestra esquemáticamente toda la secuencia del marcaje inmunohistoquímico.

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Figura 20: Esquema del proceso de marcaje inmunohistoquímico. Tras sacrificar

al animal, se procedió a la enucleación de los dos ojos y fijación en PF (4%).Posteriormente se crioprotegieron en concentraciones crecientes de sacarosa y se congelaron en OCT. Se realizaron las secciones transversales en el criostato y fueron sometidas a los procesos de lavado y marcaje con anticuerpo primario y secundario antes de ser observadas en el microscopio.

4.4.4.

Recuento de células ganglionares de la retina. Cuantificación

manual.

Todas las retinas montadas en plano e inmunológicamente teñidas con Brn3a se observaron y fotografiaron en un microscopio óptico y de fluorescencia (Olympus, modelo Provis AX-ZO Turbo interroller, EEUU) equipado con tres filtros: el ultravioleta (BP 365/12,LP 397), que permite la observación de la fluorescencia del DAPI (marcador nuclear) así como de la hidroxistilbamidina metanosulfonato

(OHSt, Molecular Probes, Leiden ,Holanda) pequeña molécula con propiedades

fluorescentes utilizada como trazador retrógrado de CGR; el de rodamina (BP 546/12,LP 590) para observar la fluorescencia roja de los anticuerpos conjugados

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con Alexa-594 (Brn3a) y el de fluoresceína (BP 450/490, LP 515-565) que permite la observación de los anticuerpos conjugados con Alexa-488 (pNFH y NFH).

La cuantificación del número de CGRs se realiza por la extrapolación del contaje manual de una serie de áreas de muestreo establecidas previamente y que son estándar. Estas áreas son representativas de la retina y engloban áreas de baja densidad y áreas de alta densidad para poder promediar el número de CGRs por unidad de superficie. El número de CGRs detectadas varía según el marcador utilizado. Los recuentos de células ganglionares de retina se realizaron en las fotografías de retina en plano inmuno-teñidas con Brn3a, en ellas se seleccionaron distintas localizaciones (tres en cada retina) para proceder al recuento celular de la zona acotada (700x300 µm²).

Para el recuento celular manual se utilizó el programa Imagen J, programa de

procesamiento de imágenes digitales desarrollado en 1997 por el National Institutes

of Health, en EEUU y de dominio público. Con el programa se seleccionaban las

zonas acotadas de la retina donde las CGR teñidas con Brn3a eran marcadas de manera manual y anotada automáticamente para su cuantificación.

Aunque este método manual de contaje es más complicado y menos fidedigno que los contajes computarizados, se sigue utilizando para cuantificar el número de CGRs trazadas que sobreviven a una lesión axonal, ya que las células de microglía se marcan transcelularmente impidiendo la cuantificación automática.

4.5.

MARCAJE ANTERÓGRADO DE LA VÍA ÓPTICA.