Interacción con el centro alostérico

Tanto el compuesto 1a como el compuesto 1g interaccionan con el bolsillo alostérico de manera similar (Figura 2.51). El inhibidor establece múltiples contactos hidrofóbicos con distintos residuos (Ala189, Leu192, Phe196, Lys197, Phe280, Ile281, Lys292 y Trp291) y forma un enlace de hidrógeno entre el nitrógeno del anillo de piridazina y la Asn193 (Figura 2.52), de manera análoga a como ocurre en el ligando cocristalizado. Analizando la superposición de ambas estructuras (Figura 2.51b), se observa una pequeña variación en su posición absoluta respecto a la enzima, con valores mínimos de desviación del valor cuadrático medio (RMSD: Root Mean Square Deviation) de los átomos pesados de 0,17 Å. La mayor variación se encuentra en el átomo de carbono unido al átomo de cloro de 1g, que se desvía 0,38 Å respecto al equivalente de 1a, produciendo una distorsión de la planaridad de este anillo aromático para acomodar el átomo de cloro dentro de la cavidad, minimizando así la repulsión estérica con las cadenas laterales de los residuos de Ala189 y Leu192 (Figura 2.53). Asimismo, se establece una interacción adicional de tipo areno-areno entre la Phe280 y la nube  del sitema bicíclico de quinoxalinio (d = 3,75-3,84 Å) (Figura 2.52).

131

Figura 2.51. (a) Cavidad ocupada por los inhibidores 1a y 1g. (b) Superposición de la estructura policíclica de los compuestos 1a y 1g. (c) Alineamiento de 1a y el ligando que cocristaliza en el complejo inhibidor-1T48. (d) Alineamiento de 1g y el ligando que cocristaliza en el complejo inhibidor-1T48.

(a) (b)

132

Figura 2.52. Enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas de PTP-1B (1T48) con (a) 1a y (b) 1g. En color morado se indican los residuos con una componente de Van der Waals más negativa.

Figura 2.53

Las afinidades predichas por XP-GlideScore son -4,5 para 1g (% I(1 M) = 48,5) y -4,1 para 1a (% I(1 M) = 36,20), siendo muy inferiores a la obtenida para el complejo inhibidor-1T48 (XP-GlideScore = -11,08) de IC50 = 350 M.

133 2.2.4.1.2. Interacción con el sitio catalítico

Los compuestos 1a y 1g interaccionan de manera distinta con el centro catalítico de PTP-1B (Figura 2.54), como se comprueba por el alto valor de distancia media cuadrática (RMS) de 5,75 Å entre los átomos del esqueleto policíclico (5,00 Å en el modo de interacción con la Cys215 neutra). Además, el modo de interacción es dependiente del estado de protonación de Cys215 como demuestran los elevados valores de RMS calculados con los átomos pesados de las dos estructuras de 1a (3,64 Å) y 1g (4,44 Å) que interaccionan con ambos estados de la proteína. Sin embargo, el estado aniónico o neutro de la Cys215 no condiciona la interacción, y tan sólo se producen mínimas variaciones en la posición global que ocupa el complejo. Es decir, tanto el modelo de docking con la forma aniónica de la enzima como con la forma neutra generan un mismo modo de interacción.

Con este estudio de docking se puede concluir que los compuestos 1a y 1g interaccionan con el centro alostérico de manera similar a como lo hace el ligando que cocristaliza en el complejo inhibidor-1T48 aunque las afinidades predichas por XP- GlideScore son inferiores a la obtenida para el ligando cocristalizado. En el caso de la interacción con el centro catalítico los dos compuestos interaccionan de manera diferente, siendo esta interacción dependiente del estado de protonación de la Cys215.

134

Figura 2.54. (a) Cavidad ocupada por los compuestos 1a y 1g. (b) Superposición de la estructura policíclica de los compuestos 1a y 1g. (c) Alineamiento de 1a y ligando que cocristaliza en el complejo inhibidor-1Q1M. (d) Alineamiento de 1g y ligando que cocristaliza en el complejo inhibidor-1Q1M.

(a) (b)

135 Los reactivos utilizados se adquirieron de las casas comerciales Aldrich y Acros y se utilizaron sin ningún tratamiento posterior.

Las reacciones que exigieron condiciones anhidras se llevaron a cabo en atmósfera de argón desoxigenado y seco. Los disolventes anhidros utilizados se secaron por destilación sobre un agente desecante adecuado, en atmósfera de argón, inmediatamente antes de su uso,160 o se hicieron pasar a través de una columna de alúmina anhidra bajo atmósfera inerte.161

Las adiciones de disolventes y disoluciones en condiciones anhidras se realizaron vía jeringa o cánula.

Para las reacciones a baja temperatura se utilizó una sonda de refrigeración Haake

EK 101.

Los puntos de fusión se determinaron en tubos capilares abiertos en un aparato

GallenKamp y se dan sin corregir.

Para la cromatografía en columna se empleó gel de sílice Merck (230-400 mesh) o alúmina neutra Fluka (0,05-0,15 mm). El eluyente empleado se indica en cada caso y las proporciones se indican volumen/volumen. Para la cromatografía analítica en capa fina se emplearon los cromatofolios de gel de sílice Merk 60 F254 o los de alúmina

neutra Polygram Alox N/UV254 de Machery-Nagel.En todos los casos el revelado de las

placas se realizó con el visor de luz UV.

Los espectros de resonancia magnética nuclear de 1H y 13C se han registrado en los siguientes aparatos: Varian UNITY-300; Varian-Mercury-VX-300 (300 MHz para 1H y 75 MHz para 13C), Varian Gemini 200 (200 MHz para 1H y 50 MHz para 13C) y en algunos casos Varian UNITYPlus-500 (500 MHz para 1H y 125 MHz para 13C). Para disolver las muestras se empleó CDCl3; CD3OD, acetona-d6 y DMSO-d6 de la casa SDS.

Los valores de los desplazamientos químicos se expresan en unidades de δ (ppm), utilizando como referencia interna la señal residual del disolvente y las constantes de acoplamiento en Hz.

160

Armarego, W. L. F.; Chai,C. L. L.Purification of Laboratory Chemical, Ed. Elsevier, 2009. 161

136

Los espectros de infrarrojo (IR) se registraron en un espectrofotómetro Perkin- Elmer modelo FTIR 1725X en las condiciones indicadas en cada compuesto (pastilla de KBr ó ventanas de NaCl) y las frecuencias de los máximos de absorción se expresan en cm-1

Los espectros de masas (EM) utilizando técnicas de ionización química (IQ) e impacto electrónico (IE) se realizaron en un espectrómetro Hewlett-Packard 5988A (70eV) y en los de ES+ en un HP 1100MSD con analizador de trampa de iones LCQ deca XP plus de la casa Thermo. Los espectros de masas de alta resolución se realizaron en un Agilent 6210 Time-of-flight LC/MS. Los datos se expresan en unidades de masa (m/e).

El microondas modelo Initiator 2.5 de Biotage se ha utilizado para las reacciones por calentamiento mediante microondas.

137 2.3. PARTE EXPERIMENTAL