Puesto que la composición de dominios funcionales de las proteínas EBS y SHL sugieren su implicación en procesos relacionados con la dinámica estructural de la cromatina, decidimos analizar también la relación genética entre EBS y SHL con otros genes implicados en procesos de remodelación de cromatina y que actúan reprimiendo la transición floral, como CLF y TFL2. CLF forma parte de un complejo polycomb PRC2 y durante la fase de desarrollo vegetativo reprime la expresión del integrador floral FT, mediando la incorporación de la marca H3K27me3 en su cromatina (Jiang et al., 2008). Los dobles mutantes ebs clf-16 tienen un fenotipo de floración muy extremo especialmente en condiciones no inductivas de DC; además el fenotipo del doble mutante muestra alteraciones pleiotrópicas del desarrollo, con una reducción acentuada tanto del tamaño de los órganos aéreos como de la fertilidad de la planta (Fig. 40). Los niveles de expresión de FT son mayores en el doble mutante ebs clf-16 que en los mutantes sencillos, lo que apoya la idea de que ambos loci interaccionen sinérgicamente en el control del tiempo de floración. Algo similar ocurre con el integrador floral SOC1, cuya expresión es mayor en el doble mutante ebs clf-16 que en clf-16, debido posiblemente a la contribución de ambas mutaciones (Fig. 41). La falta de función de ambos represores podría
DISCUSIÓN
121 causar una desorganización a nivel de la cromatina de los integradores florales, y en particular de FT, que resulta en altos niveles de expresión de ese gen en estadios de desarrollo tempranos y por tanto en un inicio de la floración extremadamente prematuro. Asimismo, otros genes implicados en el control de diversos aspectos del desarrollo estarían también severamente desregulados, lo que provoca probablemente las alteraciones pleiotrópicas del desarrollo observadas en los dobles mutantes.
Por su parte, el análisis del doble mutante shl-2 clf-16 indica una clara epistasia de clf- 16 sobre shl-2 puesto que el tiempo de floración del doble mutante es similar al del mutante clf-16 en ambas condiciones de fotoperiodo ensayadas, lo que sugiere que en ausencia de CLF funcional, la mutación shl-2 no tiene ningún efecto sobre el tiempo de floración (Fig. 39). En este caso, la expresión de los integradores florales en el doble mutante shl-2 clf-16 es solo ligeramente superior a la observada en el mutante clf-16, y no se traduce en una mayor aceleración de la floración en el doble mutante shl-2 clf-16 (Fig. 41).
Estos resultados muestran nuevamente que la interacción de EBS y SHL con otros loci implicados en la regulación de la transición floral en Arabidopsis es diferente, y corroboran de nuevo que aunque EBS y SHL tienen cierta redundancia funcional, también desempeñan funciones independientes en el control del tiempo de floración.
TFL2/LHP1 reprime la transcripción de numerosos genes incluyendo a FT (Kotake et al., 2003; Turck et al., 2007). Se ha propuesto que TFL2/LHP1 se une a la marca H3K27me3 previamente depositada en la cromatina por el complejo PRC2, manteniendo el estado reprimido de sus genes diana (Turck et al., 2007).
Los dobles mutantes shl-2 tfl2-1 y ebs tfl2-1 presentan un tiempo de floración más temprano que los mutantes sencillos, y alteraciones pleiotrópicas de diversos aspectos del fenotipo, con una reducción muy significativa del porte y la fertilidad de la planta, especialmente en el caso de ebs tfl2-1 (Fig. 42 y 43). Estos resultados junto con los datos moleculares obtenidos, donde se observa un aumento en la expresión de los integradores florales FT y SOC1 en los dobles mutantes ebs tfl2-1 y shl-2 tfl2-1, sugieren nuevamente un sinergismo entre los loci EBS y SHL con TFL2/LHP1 para el control del tiempo de floración (Fig. 44). Estos datos son consistentes con la hipótesis de que EBS y SHL estén implicados en procesos de regulación de la expresión génica a través de la modulación de la organización de la cromatina. Las plantas dobles mutantes que carecen de los mecanismos de represión mediados por estas proteínas (EBS o SHL por un lado, y CLF o TFL2 por otro) muestran una desregulación severa de los integradores florales en estadios muy tempranos del desarrollo.
DISCUSIÓN
122 Esto podría deberse a una desorganización de la cromatina de estos loci que conduce a la pérdida de la conformación inactiva en transcripción que deberían presentar los integradores florales en los estadios iniciales del crecimiento de la planta de Arabidopsis. La relajación de esta estructura no permisiva facilitaría la expresión temprana de dichos genes, provocando una reducción drástica de la fase de crecimiento vegetativo en estas plantas dobles mutantes. La activación de otros genes a lo largo de distintos estadios de desarrollo sería responsable de las alteraciones pleiotrópicas del fenotipo observadas en estos dobles mutantes.
Será de gran interés caracterizar en mayor profundidad los mecanismos represores de la transcripción en los que participan estas proteínas y establecer como interaccionan entre sí para modular con precisión el estado transcripcional de la cromatina de genes maestros del desarrollo como FT y SOC1. Los datos que hemos obtenido hasta el momento indican que EBS y TFL2 no interaccionan físicamente en ensayos de doble híbrido en levadura (datos no mostrados). Sin embargo, esto no nos permite descartar que en el entorno de la cromatina de Arabidopsis, estas proteínas puedan formar parte de complejos de orden superior implicados en regular la expresión de genes de tiempo de floración.