Interacciones proteína/pared celular y localización final (compartimentación)

Salvo excepciones, la mayoría de las peroxidasas vegetales llevan uno o dos glicanos unidos al sitio de N-glicosilación que pueden participar, junto con las propiedades de carga superficial, en el reconocimiento de proteínas y/o en las interacciones proteína/pared celular que determinan el tráfico celular de las proteínas y su localización final, lo que se denomina compartimentación.

Los sitios de N-glicosilación (205-NSSD) en AtPrx4, (211-NSSD) en AtPrx5, (213-NETN) en AtPrx52, (214-NSTN) en AtPrx68, (205-NASN) en AtPrx67 (224- NHTG) en AtPrx36, (218-NQSG) en AtPrx14, (213-NQSG) en AtPrx49 y (216-NQSG) en AtPrx72 se encuentran en una región inmediatamente aguas arriba del bucle de la hélice F' (figura III.2). Debido a que este glicano unido al sitio de N-glicosilación está cerca de la histidina proximal (figura III.2), esta glicosilación probablemente afecta a la dinámica de la reacción; dato que se ve reforzado por las propiedades catalíticas diferenciales de ZePrx (Gabaldón et al., 2006). Además, puesto que la hélice F' se encuentra en la región superficial de las AtPrxs (Østergaard et al., 2000), y por analogía a la región superficial de ZePrx (Gabaldón et al., 2007), también es probable que los glicanos unidos a los sitio de N-glicosilación que se mencionaron anteriormente, participen en el reconocimiento de proteínas y/o en interacciones de membrana (proteína/pared celular) que determinan el tráfico celular de las AtPrxs, y su localización final (compartimentación).

Las singulares propiedades de superficie de las AtPrxs podrían determinar la naturaleza de estas interacciones. En AtPrx 4, 5, 52, 68, 67, 49 y 72, la proteína madura tiene un carácter fuertemente básico, mientras que en AtPrx36 y AtPrx14 es de carácter fuertemente ácido (ver pI en la tabla III.1). Después de la corrección del pI (ΔpI ~ 2,0) para los dos iones de calcio y el hemo (Welinder et al., 2002), el pI teórico para cada AtPrx es mucho más básico que el valor experimental determinado previamente (López- Serrano et al., 2004).

Las características de carga superficial son aún más evidentes cuando se calcula la carga de la superficie molecular de las AtPrxs utilizando interacciones simples de Coulomb (figura III.4). El cartografiado del potencial electrostático demostró una característica distribución irregular de cargas en la superficie de todas las AtPrxs con un

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predominio casi total de cargas netas de superficie positivas (figura. III.4, sombreado en azul), excepto en AtPrx 36 y 14. Sin embargo, el patrón de sombreado de la superficie de AtPrx 4, 5, 52, 49 y 72 no es proporcional a la composición de aminoácidos ácidos/básicos.

De hecho, a un pH de 7,0 y excluyendo los dos H, AtPrx 4, 5, 52, 49 y 72 presentan una diferencia pequeña entre los aminoácidos cargados positivamente y los aminoácidos cargados negativamente. El mapa del potencial electrostático (figura III.4) demostró que en la superficie de la proteína los aminoácidos cargados negativamente de estas cinco AtPrxs estaban en su mayoría recubiertos por amino ácidos cargados positivamente, lo que resulta en un inusual patrón de carga electrostática superficial neta positivo.

Esta inusual carga superficial debe tenerse en cuenta pues tiene un significado biológico, ya que estas propiedades de superficie singulares de las AtPrxs son esenciales en las interacciones proteína/pared celular.

Sin embargo, debido a su alto punto isoeléctrico (tabla III.1) y a las propiedades de carga superficial (figura III.4), se podría esperar que las AtPrxs (excepto AtPrx36 y 14) estén unidas firmemente a la matriz péctica de la pared celular primaria (Ferrer et al., 1992). Las interacciones entre la proteína básica y la matriz péctica pueden ser atenuadas por el recubrimiento con glicanos, siendo el mejor ejemplo de esto la extensina (Cassab y Varner, 1988). De esta manera, los glicanos de las AtPrxs podrían reducir las interacciones electrostáticas con las pectinas, permitiendo que las AtPrxs puedan moverse libremente en la matriz de la pared celular y alcanzar la pared celular secundaria, donde después de comenzar la formación de la pared celular primaria, inician la deposición de lignina (Smith et al., 1994).

Para apoyar esta conclusión, hay que destacar que los sitios de N-glicosilación descritos anteriormente para cada AtPrx se encuentran en una zona de superficie con un alto predominio de carga superficial neta +4,0 C (figura III.4), provocado por la presencia de un mayor número de aminoácidos básicos (figura III.2, K y R, subrayado ondulado de color azul) que de aminoácidos ácidos (figure III.2, E y D, subrayado ondulado de color rojo), constituyendo estas zonas el mejor dominio de superficie de las AtPrxs para las interacciones con pectinas (figura III.4). Sin duda, la ubicación de los glicanos en esta zona de carga neta positiva debería atenuar las interacciones

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electrostáticas de las AtPrxs con las pectinas. En este punto, es interesante recordar que las AtPrxs no contienen el clúster de cuatro residuos de arginina (R117, R262, R268 y R271) responsables de las interacciones con pectinas (Carpin et al., 2001).

Como se mencionó anteriormente, AtPrx 36 y 14 tienen propiedades peculiares de superficie, con una carga superficial predominantemente de -4,0 C (figura III.4, sombreada en rojo), haciendo que su ubicación sea muy diferente a la de ZePrx y siendo este un factor determinante para descartarlas como peroxidasas involucradas en el último paso de la biosíntesis de ligninas.

A la vista de los estudios realizados y de los resultados obtenidos, AtPrx 4, 5, 52, 49 y 72 fueron las peroxidasas con el patrón de carga de superficie más parecido al de ZePrx, y esto, junto con sus características de estructura 3D descritas anteriormente, las hacen ser las candidatas mejor posicionadas hasta el momento.

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Figura III.4. Estructura de la superficie y mapeo del potencial electrostático de las AtPrxs de acuerdo con la estructura 3D predicha (ver figura. III.3). Las cargas superficiales se calcularon utilizando interacciones simples de Coulomb. La proteína se considera a pH 7,0, con un estado de protonación por defecto para todos los residuos. Sólo los residuos cargados (R, K, E y D) se tuvieron en cuenta y las cargas se encuentran en las correspondientes posiciones de los átomos (sin H). Las cargas superficiales netas de las imágenes oscilaron entre -4,0 C (rojo) a +4,0 C (azul). Los potenciales electrostáticos superficiales fueron asignados mediante el método de cálculo de Coulomb, suponiendo una constante dieléctrica (disolvente) de 80,000. Tomado de Herrero et al. (2013a).

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