Genetic diversity was detected in 15 varieties of triticale (XTriticosecale Wittmack., 2n = 2x = 42, AABBRR) registred in the Czech Republic by means of polymorphism of DNA using the RAPD method and the SSR method.
Key words: triticale, polymorphism of DNA, RAPD, SSR
Úvod
Pro detekci genetické variability (diverzity) je v současné době k dispozici mnoho metod, např. morfologická charakteristika, analýza rodokmenů, biochemické markery především bílkoviny a jejich různé izoenzymové varianty, molekulární (DNA) markery atd.
Materiál a metody
Genetická variabilita byla detekována u 15 genotypů tritikale (XTriticosecale Wittmack.). Jednalo se o následující genotypy: ozimá forma – Disco, Kitaro, Kolor, Lamberto, Lupus, Marko, Modus, Presto, Sekundo, Ticino, Tornádo, Triamant, Tricolor; jarní forma – Gabo a Legalo. Směsné vzorky certifikovaného osiva byly získány z Ústředního kontrolního a zkušebního ústavu zemědělského, zkušební stanice Hradec nad Svitavou. Jako genetických markerů bylo využito polymorfizmu DNA, který byl detekován metodou RAPD a metodou SSR. Pro molekulární analýzy byla genomová DNA izolována pomocí izolačního kitu DNAesy Plant Mini Kit (f. Qiagen) z napěstovaných rostlin ve fázi 1. pravého listu. Koncentrace DNA ve vzorku byla po izolaci zjištěna spektrofotometricky. Před vlastními RAPD analýzami byla templátová DNA naředěna v poměru 1:1-2, tak aby výchozí množství DNA do reakce odpovídalo 25 ηg.µl-1. Pro RAPD analýzy bylo použito 80 RAPD primerů. Složení „master mixu“ bylo následující: 10x reakční pufr (koncentrace 1x), dNTP (c-0,1 mM), testovaný primer (30 ng.μl-1), Taq DNA polymerasa (Finnzymes) 2U. μl-1, 2x deionizovaná voda; teplotní a časový profil reakce byl: 1 cyklus 94oC – 60 s; 45x (94oC – 60 s, 35oC – 120 s, 72oC – 60 s), 1 cyklus 72oC – 600 s. Elektroforetická separace RAPD produktů byla provedena na 1,5 % agarozovém gelu a vizualizace byla provedena pomocí ethidiumbromidu. Pro SSR analýzy byly použity 2 SSR markery. Reakční směs o celkovém objemu 25 μl obsahuje: 30 ηg templátové DNA, 0,5 U Taq polymerázy (Promega, USA), 1x odpovídající pufr, 7,5 μM každého primeru a 0,1 mM každého dNTP. Teplotní a časový profil reakce byl: 1 cyklus 93oC – 120 s; 30x (93oC – 60 s, 54oC – 120 s, 72oC – 120 s). Pro vizualizaci produktů bylo použito barvení stříbrem (0,2 % AgN03) po proběhlé vertikální elektroforéze (při 300 V) na 15 % denaturovaném polyakrylamidovém gelu v TBE pufru. Výsledky molekulárních analýz byly vyhodnoceny pomocí 1 (přítomnost produktu) a 0 (nepřítomnost produktu). Následně byly tyto hodnoty statisticky zpracovány pomocí programu FreeTree a graficky zpracovány do podoby dendrogramu pomocí programu TreeView.
Výsledky a diskuse
GARG et al. (2001) vyhodnotili metodu RAPD jako druhou nejvhodnější, po metodě SSR a před
metodou AFLP, pro mapování genetické diverzity u tritikale. V našem případě poskytovali jednotlivé RAPD primery rozdílný polymorfizmus získaných DNA produktů. Z použitých 80 RAPD primerů poskytovalo 8 primerů uniformní spektrum produktů pro všech 15 odrůd tritikale. Zbývající primery výrazně rozlišily odrůdy Kolor, Modus a Tornádo od ostatních odrůd, které tvoří čtyři skupiny (obr. 1a). V jedné z těchto skupin se vyskytují jarní odrůdy Gabo a Legalo společně s ozimými odrůdami Tricolor a Triamant. Využití RAPD primerů neumožnilo, vzhledem k použití směsného vzorku (miniprep), detekovat genetickou variabilitu v rámci jednotlivých genotypů na rozdíl od prolaminových bílkovin obilky tritikale (VYHNÁNEK, BEDNÁŘ, 2003).
Byla otestována metodika detekce SSR markerů pšenice u tritikale. Na základě sestaveného dendrogramu se podařilo odlišit za pomocí 2 SSR markerů odrůdu Trimaran a ostatních analyzovaných odrůd (obr. 1b). V dendrogramu lze pozorovat klastr jarních forem tritikale (Gabo a Legalo). Detekcí variability DNA s využitím 80 RAPD primerů bylo rozlišení jarních forem tritikale od ozimých nižší. SSR markery jsou lokalizovány na krátkém rameni 1A chromozomu [Xpsp2999, motiv (CAG)5 (CAA)8] a krátkém rameni 1B chromozomu [Xpsp3000, motiv (CAA)15]. SSR marker Xpsp2999 využili BOUGOT et al. (2002) k rozlišení alel Pm3 rezistence k Blumeria graminis. DEVOS et al. (1995) uvádějí vazbu tohoto markeru s LMW gluteniny a gliadinovým genem Gli 1-1. V našem případě se velikost produktů pohybovala v rozmezí 140- 160 bp. Byly detekovány 4 alelické varianty. MANIFESTO et al. (2001) při použití tohoto SSR markeru u pšenice detekovali produkty s obdobnou velikostí (133-157 bp) a popsali 11 alelických variant včetně nulové alely. Nulová alela u analyzovaných odrůd tritikale nebyla detekována. U SSR markeru Xpsp3000 byla popsána vazba s γ-gliadiny (DEVOS et al., 1995) a produkt o velikosti 285 bp je ve vazbě s genem
Zborník z 12. odborného seminára, Piešťany : VÚRV, 2005
Yr10vav rezistence ke rzi plevové (BARIANA et al., 2002). MANIFESTO et al. (2001) uvádějí u pšenice 13 alelických variant (213-285 bp) včetně nulové. U námi analyzovaných odrůd se velikost produktů pohybovala v rozmezí 200-260 bp. Alela o velikosti 260 bp byla detekována jen u odrůdy Triamant.
Závěr
V práci jsou prezentovány výsledky RAPD a SSR analýz u 15 genotypů tritikale, které je možné využít pro detekci genetické variability a rozlišení jednotlivých analyzovaných genotypů tritikale.
Literatura
1. BARIANA, H.S. - BROWN, G.N. - AHMED, N.U. - KHATKAR, S. - CONNER, R.L. - WELLINGS, C.R., HALEY, S. - SHARP, P.J. - LAROCHE A. (2002): Characterisation of Triticum vavilovii-derived stripe rust resistance using genetic, cytogenetic and molecular analyses and its marker-assisted selection. In: Theor. Appl. Genet., 104, 2002, 2-3, s. 315-320.
2. BOUGOT, V. - LAMOINE, J. - PAVOINE, M.T. - BARLOY, D. - DOUSSINAULT, G. (2002): Identification of a microsatellite marker associated with Pm3 resistance allels to powdery mildew in wheat. In: Plant Breed., 121, 2002, s. 325-329.
3. DEVOS, K.M. - BRYAN, G.J. - COLLINS, A.J. - STEPHENSON, P. - GALE, M.D. : Applications of two microsatelite sequences in wheat storage proteins as molecular markers. In: Theor. Appl. Genet., 90, 2, 1995, s. 247-252.
4. GARG, M. - SINGH S. - SINGH B. – SINGH, K. – DHALIWAL, H. S.: Estimates of genetic similarities and DNA fingerpriting of wheats (Triticum species) and triticale cultivars usin molecular markers. Indian J. Agric. Sci., 71, 2001, s. 438-433.
5. MANIFESTO, M.M. - SCHLATTER, A.R. - HOPP, H.E. - SUAREZ, E.Y. - DUBCOVSKY, J.: Quantitative evalution of genetic diversity in wheat germplasm using molecular markers. In: Crop Sci., 41, 2001, s. 682-690.
6. VYHNÁNEK T. - BEDNÁŘ J.: Detection of the varietal purity in sample of harvested wheat and triticale grains by prolamin marker. In: Plant Soil Environ., 49, 2003, s. 95-98.
*Práce vznikla za finanční podpory projektu GA ČR č. 521/03/P173.
a) b)
A B C
Obr. 1 Dendrogramy podobnosti analyzovaných genotypů tritikale (Jaccard, P=99%) a) RAPD primery, b) SRR markery
Adresa autora:
Ing. Tomáš Vyhnánek, Ph.D., Doc. Ing. Jan Bednář, CSc., Ústav biologie rostlin, Agronomická fakulta, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika.
Zborník z 12. odborného seminára, Piešťany : VÚRV, 2005