El algodón GHB614 se obtuvo mediante la trasformación genética de la variedad de algodón Coker 312 con el sistema Agrobacterium tumefaciens, utilizando el vector pTEM2. Este vector contiene una construcción quimérica única del gen, diseñada para ser funcional en plantas y conferir tolerancia al herbicida glifosato: Ph4a748A -intron1h3At- TPotpC:: 2mepsps::3'histon4At.
El sistema de transformación con A. tumefaciens ha sido ampliamente estudiado y se ha empleado como herramienta biotecnológica rutinaria para el desarrollo de plantas transgénicas durante muchos años. A. tumefaciens es una bacteria fitopatógena que habita de manera natural en el suelo, la cual utiliza un proceso de ingeniería genética natural para alterar la maquinaria metabólica de las células de la planta hospedante (Tempé et al., 1977; Chilton et al., 1977). Esta bacteria, además de su cromosoma circular, posee un plásmido de aproximadamente 200 kilobases denominado plásmido Ti (del inglés tumor-inducing). Este plásmido contiene una secuencia bien definida de DNA de aproximadamente 35 kilobases y delimitada hacia ambos extremos por una franja repetida de 25 pares de bases, llamada T-DNA (del inglés Transferred DNA, DNA transferido). Asimismo, en otra parte del plásmido, fuera de la región del T-DNA, se halla la región vir que interviene en la transducción de señales en la bacteria y en la regulación del proceso de transferencia del T-DNA (Zambryski, 1988). La comprensión de este proceso natural de transformación y el hecho de que cualquier DNA externo colocado entre los bordes del T-DNA puede ser transferido e integrado de manera estable dentro del cromosoma de las células vegetales, ha permitido la construcción de vectores para la transformación genética de varias especies de plantas (Deblaere et al., 1985; Hooykaas & Shilperoort, 1992).
Los explantes derivados del algodón Coker 312 fueron expuestos a un cultivo de Agrobacterium tumefaciens que contenía el plásmido pTEM2. Después del co-cultivo, las células de algodón fueron regeneradas mediante cultivo de tejidos hasta producir una planta completa. El medio de cultivo fue adicionado con 500 mg/L de claforan para eliminar las bacterias remanentes (FSANZ, 200837). La actividad de la proteína expresada por el gen 2mepsps introducido fue confirmada asperjando las plántulas de algodón con el herbicida glifosato. Las plántulas sobrevivientes se cultivaron en invernadero y después se seleccionaron en base a su resistencia al glifosato. La progenie fue autopolinizada y las plantas homocigotas
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fueron retrocruzadas con el parental recurrente para obtener material homocigótico para análisis posteriores (verificación del inserto por Southern Blot o PCR), o cruzadas con germoplasma elite en programas de mejoramiento genético para desarrollar nuevas variedades de algodón tolerantes a glifosato (sección j.2).
2. Evento LLCotton25.
El algodón Libertad Link® fue producido por la transformación mediada por Agrobacterium (Zambryski 1992) utilizando la variedad de algodón Coker 312 y el evento de transformación LLCotton25. Agrobacterium tumefaciens es una bacteria gram-negativa común del suelo que causa la enfermedad de agalla en una amplia variedad de plantas. En el uso de vectores de Agrobacterium se transfiere sólo el T-ADN y se integra en el genoma de la planta (Chilton et al 1977;.. Zupan et al 2000), aunque las secuencias del vector que flanquean los extremos también se pueden transferir. En general la transferencia de T-ADN en células vegetales por Agrobacterium es irreversible (Huttner et al. 1992) y no se puede volver a movilizar y transferir en otras partes del genoma o a otros organismos. La transformación mediada por Agrobacterium se ha usado ampliamente para la introducción de genes en las plantas sin causar preocupaciones de bioseguridad o reacciones adversas.
Cepas de Agrobacterium desacopladas se han construido específicamente para la transformación de plantas. Las cepas desacopladas no contienen los genes responsables de la sobreproducción de auxina y citocinina (iaaM, iaaH y ipt), que son necesarios para la inducción de tumores y el crecimiento rápido de callos (Klee y Rogers 1989). Los vectores de los plásmidos de Agrobacterium utilizados para la transferencia de T-ADN, contienen segmentos de ADN bien caracterizados necesarios para su replicación y selección en bacterias, y para la transferencia del T-ADN de Agrobacterium y su integración en el genoma de la célula de la planta (Bevan 1984; Wang et al 1984). En este caso, se utilizó el plásmido pGSV71 de vector binario (Berghman 2003) para introducir el gen bar en la variedad Coker 312. Este plásmido es un derivado del plásmido pGSC1700 (Cornelissen y Vandewiele, 1989). Los elementos genéticos de pGSV71 que fueron transferidos en el genoma vegetal se describen en la sección I.j.
El plásmido pGSV71 también lleva una copia del gen marcador de seleccion aadA del transposón bacteriano Tn7 (de Escherichia coli), que confiere resistencia a los antibióticos estreptomicina y espectinomicina, para la propagación y selección del plásmido en bacterias y A. tumefaciens. Sin embargo, este gen marcador no se transfiere al genoma de las plantas de algodón LibertyLink® (FSANZ, 200838).
El vector de plásmido pGSV71 se mantuvo en Escherichia coli, y se transfiere a una cepa de Agrobacterium tumefaciens antes de insertar la transformación. Después de co-cultivo con A. tumefaciens, las células de algodón se cultivaron en presencia de fosfinotricina (un análogo de glufosinato de amonio), para seleccionar las que contienen el gen bar insertado (ya que el gen bar confiere tolerancia a la fosfinotricina). Posteriormente, las plantas de algodón transgénicas que contienen el gen bar se regeneraron a partir de estas células y se realizaron ensayos para la tolerancia a herbicidas. Se seleccionó el evento de transformación LLCotton25. Esta línea
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contenía una sola copia del gen bar, y mostró, tolerancia a los herbicidas de manera consistente y eficiente tanto en el laboratorio, así como durante las pruebas de campo en los EE.UU.
Las variedades de algodón transgénicos propuestos para la liberación (conocidas como algodón LibertyLink®) son la progenie de retro cruzamiento del algodón transgénico que contiene el evento de transformación LLCotton25 y un número de variedades de algodón convencionales que son adecuados para las zonas de producción de algodón de la región solicitada.
3. Algodón GlyTol® LibertyLink® (GHB614 x LLCotton25).
El algodón GHB614 x LLCotton25 fue obtenido mediante técnicas de mejoramiento convencional a partir de los eventos parentales GHB614 y LLCotton25 como se ilustra en la
figura 23. No se ha efectuado ninguna modificación genética adicional. Toda la información que describe la modificación genética se refiere a los eventos parentales individuales.
Figura 23. Esquema del proceso de cruzamiento convencional para la obtención del algodón GHB614 x LLCotton25.
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I.l. Descripción, número de copias, sitios de inserción y expresión de las secuencias