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P R E S E N TA C I Ó N
La microscopía electrónica de transmisión permite vi-sualizar las estructuras internas de las células de un or-ganismo y detectar los cambios que son consecuencia de una infección por un entomopatógeno.
Las poblaciones de Hylesia metabus (Cramer, [1775]) son controladas actualmente con una cepa co-mercial de Bacillus thuringiensis var. kurstaki (Btk); sin embargo, el valor del insecticida biológico y el alto costo de las aplicaciones han promovido la búsqueda de con-troles alternativos. Una fuente potencial son los contro-ladores naturales, entre ellos los parásitos y patógenos de la zona donde habita H. metabus. Los patógenos autóc-tonos tienen la ventaja que perturban menos al ambiente que los controladores introducidos y tienen menos im-pacto sobre otros organismos.
En experimentos preliminares de campo realizados por Vásquez (1990) se encontró que uno o más patóge-nos causaron una mortalidad de 80 % en larvas de cuar-to y quincuar-to instar de H. metabus. Las larvas enfermas presentaban sintomatologías que sugerían la presencia de una infección bacteriana o viral; se tornaron fláci-das, aletargafláci-das, dejaban de alimentarse y finalmente morían. En este trabajo se investiga la presencia de pató-genos en los intestinos de larvas enfermas de H. metabus mediante microscopía electrónica de transmisión, para verificar cuál o cuáles podrían ser los responsables de la mortalidad en las larvas.
Existen diferentes tipos de organismos patógenos que atacan a los insectos, entre ellos los virus, bacte-rias, protozoarios, hongos y nemátodos. Los primeros en detectar patologías en los insectos fueron los griegos:
Aristóteles (384-322 A.C.) observó que las abejas pre-sentaron anormalidades o enfermedades que él describió como «óxidos» (Steinhaus 1956), y los chinos quienes hacían reportes de enfermedades en el gusano de la seda en el siglo 7 A.C. (Wang 1965). Sin embargo, no fue sino hasta 1835 cuando Agostino Bassi, identificó el primer patógeno, un hongo, que luego fue nombrado Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin, agente causal de una enfermedad infecciosa en el gusano de la seda (Steinhaus 1956; 1975).
A partir de mediados del siglo XIX se sabía que los microorganismos patógenos eran los que causaban las enfermedades en los insectos. A finales del siglo XIX y principios del siglo XX hubo un creciente interés en los hongos como agentes de control de los insectos plaga.
No obstante, los intentos fallaron o no fueron aplicados fuera del ámbito de los trabajos de investigación (Tana-da & Kaya 1993).
En 1901, Bacillus thuringiensis (Bt) Berliner, 1911 fue aislado del gusano de la seda, Bombyx mori L. 1758, (Ishi wata 1901). Luego de muchos años de investigacio-nes, Bt y formulaciones comerciales basadas en los dife-rentes serotipos de Bt, han llegado a ser muy exitosas y hoy en día son los controladores biológicos más uti-lizados contra los insectos plaga. Sin embargo, repre-sentantes de todos los grupos de patógenos; bacterias, hongos, virus nemátodos y protozoa (mayormente los microsporidios) son actualmente utilizados de manera exitosa contra una amplia gama de insectos plaga de cultivos y de la salud pública (Tanada & Kaya 1993).
Los diferentes patógenos producen diversos signos y síntomas en los insectos afectados, entre ellos, cambios en el color del insecto, visualización directa del patóge-no, comportamiento aberrante del insecto, cambios en la forma y textura del cadáver y el olor del mismo, los cuales ayudan al investigador a distinguir entre los pató-genos y permiten realizar un diagnóstico preliminar de la posible causa de una infección (Tabla 1).
Otros técnicas, entre ellas la microscopía elec-trónica, también pueden ayudar a elucidar cuales son el o los patógenos responsables de una enfermedad.
Tabla 1. Síntomas más típicos de los grupos de agentes entomopatógenos de mayor importancia (Lacey & Brooks 1997).
Grupo Síntoma
Virus Enfermedad aguda. Produce cambios en la coloración del insecto infectado y a veces vómito o diarrea. Al morir, el integumento se torna flácido y frágil.
Nemátodos Enfermedad aguda. Produce cambios en la coloración. Se puede visualizar los nemátodos a través de la cutícula.
Hongos Enfermedad aguda. Se puede observar la presencia del micelio y esporas sobre el integumento del insecto. Al morir se momifica.
Bacteria Enfermedad aguda. Produce cambios en la coloración del integumento y pérdida del apetito. Al morir el insecto se torna flácido inicialmente para luego secarse y contraerse.
Microsporidios Enfermedad crónica. Causa un crecimiento irregular, letargo, pérdida del apetito y la malformación de pupas y adultos, éstos últimos con la fecundidad y longevidad reducidas.
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controles para examinarlos mediante microscopía electrónica de transmisión. Para ello, se extrajeron los intestinos medios, se cortaron en trozos de 1mm3 y se sumergieron inmediatamente en prefijador fresco (gluteraldehido al 25 % y paraformaldehido al 1 %) en una solución búfer fosfato (PBS), pH 7,2 y 260 mOsm/l. Después de tres lavados con PBS pH 7,2, se posfijaron los intestinos en una solución de tetróxido de osmio (OsO4) al 1 % en una PBS durante 90 mi-nutos, luego los tejidos se lavaron en búfer fosfato tres veces, y se deshidrataron en una serie creciente de eta-nol (Stobbart & Shaw 1964; Crossley & Waterhouse 1969; Lu & Chow 1991). Las muestras, después de la deshidratación fueron infiltradas con óxido de propi-leno, e incluidas en la resina epóxica Polybed 812®, para luego ser incubadas a 60°C por 48 horas. Se rea-lizaron cortes ultrafinos, de 60-70 nm, con un ultra-microtomo Reichart-Jung, y se tiñeron con acetato de uranilo al 6 % por cinco minutos y citrato de plomo por tres minutos. Las observaciones y fotografías se hicieron en un microscopio electrónico de transmisión marca Hitachi, modelo H-600 (Tovar 2001).
Aproximadamente 50 larvas sanas del quinto ins-tar de H. metabus se recolecins-taron de los manglares cerca del poblado de Yaguaraparo, distrito Cajigal, estado Su-cre, Venezuela y se trasladaron al Instituto de Investi-gaciones de Biomedicina y Ciencias Aplicadas (IIBCA), Universidad de Oriente, donde se mantuvieron en re-cipientes plásticos a 26 ± 2 °C y humedad relativa de 60-70 %. Las larvas enfermas o muertas posiblemente por patógenos también se recolectaron y se mantuvieron separadas de las larvas sanas
Las larvas enfermas y las muertas fueron licuadas y con ellas se preparó una solución con agua destilada esté-ril a una concentración de 1:10. Esta fue suministrada a 10 de las larvas sanas abriendo para ello su aparato bucal y suministrando, con la ayuda de una microjeringa, 3 µl de la misma. Las larvas se dejaron durante seis horas en reci-pientes plásticos con hojas frescas de su planta hospedera, Rhizophora mangle L. (mangle rojo). Como controles se utilizaron 10 larvas que fueron tratadas de la misma ma-nera, pero solamente con agua estéril.
Transcurridas las seis horas, se prepararon los intestinos de las larvas infectadas y los respectivos
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Las micrografías de la ultraestructura del intestino medio de las larvas sanas muestran un tejido compacto típico de células del intestino, con numerosos microve-llos en la zona apical, mitocondrias y retículo endoplas-mático rugoso (Figura 1A). La zona basal del intestino se encuentra muy plegada, con mitocondrias repartidas entre los pliegues formando el laberinto basal. Debajo de la membrana basal está el tejido muscular, los nervios y traqueolas (Figura 1B).
En las larvas infectadas, las células se elevaron e hin-charon (vesiculación) en la zona apical y hubo una dismi-nución notable de los microvellos además de la desaparición de los microfibrillas (Figura 1C). Los organelos se hincha-ron, especialmente las mitocondrias y el retículo endoplas-mático rugoso (Figuras 1C y D) y hubo un esclarecimiento del citoplasma y una desintegración del tejido en general (Figura 1D). En el laberinto basal aparecieron numerosas vacuolas y una separación de los pliegues y de las
membra-nas entre las células (Figura 1E). No se observó la presencia de cuerpos virales en ninguna de las larvas examinadas.
Los fenómenos de las alteraciones del epitelio, como lo son el hinchamiento y vesiculación de las células en la zona apical, evidencian en las larvas infectadas las características de una patología bacteriana (Ebersold et al. 1977; Charles
& de Barjac 1983). Este tipo de infección ha sido reportado en varias especies de insectos contagiados con Bacillus thu-ringiensis (Bt), como por ejemplo: Bombyx mori Linnaeus, 1758 (Lepidoptera) (Percy & Fast 1983), Corcyra cephalo-nica (Stainton, 1866) (Lepidoptera) (Chiang et al. 1986), Bovicola ovis Schrank (1781), (Anoplura) (Hill & Pinnock 1998), Chironomus thummi thummi Kieffer (1911) y Psectro-cladius psilopterus (Kieffer, 1906) (Diptera) (Yiallouros et al.
1999), entre otros. La desaparición de las microfibrillas fue reportado en B. mori infectada con Bt (Percy & Fast 1983).
El hinchamiento del retículo endoplasmático rugo-so también es consistente con observaciones en larvas de
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mosquitos y lepidópteros infectadas con Bt y es aparente-mente causado por un ingreso de agua a la célula y a sus organelos (Ebersold et al. 1977; Charles & de Barjac 1983;
Bauer & Pankratz 1992). Por otro lado, el rompimiento de la membrana nuclear es otro síntoma de necrosis de la célula (Percy & Fast 1983). La vacuolización y
rompi-miento de las membranas celulares en el laberinto basal han sido reportados para C. thummi thummi y P. psilopterus infec-tadas con B. thuringiensis var. san diego, en las que se observó la unión de vacuolas ba-sales para formar grandes vacuolizaciones del citoplasma (Bauer & Pankratz 1992).
Percy & Fast (1983) señalan que los cambios ultraestructurales en los in-testinos de insectos tratados con Bt son indicadores de daños celulares generaliza-dos y necrosis y no son atribuibles a una acción específica de la toxina de Bt. Los daños producidos por el agente patógeno en los intestinos de H. metabus también son respuestas generalizadas. La carencia de cuerpos virales en las muestras indica que los daños ultraestructurales observa-dos fueron probablemente produciobserva-dos por una o más bacterias patógenas.
Osborn et al. (2002) aislaron e iden-tificaron 29 cepas de bacterias de larvas de H. metabus sanas y larvas infectadas con el mismo homogenato de larvas muertas que se utilizó para infectar las larvas en este trabajo. Entre estas cepas se identifi-caron: Providencia rettgeri (Hadley 1918), Alcaligenes faecalis Castellani & Chalmers 1919 y Pseudomona aeruginosa (Schroeter 1872) Migula 1900. De éstas, solamen-te P. aeruginosa fue patógena, causando una mortalidad de entre 60 y 93,3 % en larvas del quinto estadio de H.
metabus (Osborn 2002). Sin embargo, debido a que P.
aeruginosa es un patógeno facultativo de humanos inmu-nocomprometidos, no se pudo recomendar su uso en un programa de control biológico de H. metabus.
Figuras 1A y B. Intestino medio de larvas sanas de Hylesia metabus. Figura 1A. Zona api-cal. M: mitocondria, Mv: microvellos, flecha: microfibrillas, (): retículo endoplasmático rugoso. Figura 1B. Zona basal Mu: músculo, Lb: laberinto basal, N: núcleo, flecha: mito-condria. Figuras 1C-E. Intestino medio de larvas infectadas. Figura 1C. Zona apical. Mv:
microvellos, note la vesiculación de la membrana apical (flecha), la desaparición de las microfibrillas y el hinchamiento del retículo endoplasmático rugoso (). Figura 1D. Detalle de los daños intracelulares. Note el esclarecimiento del citoplasma, la aparición de espa-cios (flecha) y el hinchamiento del retículo endoplasmático rugoso (). Figura 1E. Zona basal. Note la separación de los pliegues () y de las membranas celulares (flecha). M:
mitocondria, V: vacuola.
C O N C L U S I O N E S Y R E C O M E N D A C I O N E S
Aunque la solución de larvas muertas pudo ha-ber contenido diversos patógenos, entre ellos, hon-gos, virus y microsporidios, los daños ultraestructu-rales observados en los intestinos de las larvas trata-das son características de una infección bacteriana.
En tal sentido, se recomienda seguir realizando es-tudios microbiológicos con el objetivo de identificar
bacterias gram positivas que pudieron ser las respon-sables de la sintomatología observada.
AG R A D E C I M I E N T O S
Al personal de Fundacite-Sucre y del Programa Hylesia metabus, Dirección General de Salud Ambiental
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y Contraloría Sanitaria, Región IV, Maturín, Monagas por su invalorable apoyo en la recolección de las larvas.
Este estudio fue financiado en parte por el Consejo de Investigación de la Universidad de Oriente, Proyecto No. CI-5-1901-0820198 y por Conicit a través del FIR (Fondo de Investigación Regional).
B I B L I O G R A F Í A
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