TABLA 12 Sistema de graduación Murray y Washington para el ensayo de calidad de muestra de esputo
3. KOH al 10%: para descartar la presencia de estructuras fúngicas.
d) Cultivo de esputo: entre los medios de cultivos primarios tenemos: agar sangre, agar
chocolate, agar Mac Conkey y para investigar micobacterias se puede utilizar: Agar
LáMInA nº rESULTADo nº
Columna 11
Löwenstein-Jensen, ogawa Kudoh o Middlebrook 7H10-7H11; dependiendo de la orientación diagnóstica se incluirán medios específicos para hongos dimorfos tales como: agar infusión cerebro-corazón, así como agar infusión de corazón de Sabouraud (SABHI) con sangre de oveja y también Micobiotic o Mycosel, en caso de sospecha de infección por Legionella se usa el agar extracto levadura carbón con pH regulado (BCYE) y tinción específica para P. carinni.(15, 16)
En la Figura 9 se representa esquemáticamente el procedimiento para el cultivo de la muestra de esputo o expectoración.
Figura 9. Procedimiento para el cultivo de esputo
Para el aislamiento de micobacterias antes de realizar la siembra en el medio de cul- tivo se debe realizar un proceso de descontaminación debido a que es necesario eliminar de las muestras los microorganismos contaminantes que interfieren en el desarrollo de estas bacterias. También es importante conseguir la licuefacción de los restos orgánicos (tejidos, moco y otros materiales) que rodean a los microorganismos, para que los agen- tes descontaminantes puedan destruir las bacterias no deseadas.
Pero si éstas no se utilizan adecuadamente pueden afectar, también la viabilidad de las micobacterias presentes en la muestra y dar lugar a falsos cultivos negativos (por
AS ACH AMK
Incubación 18-24 h a 36°C
en microaerofilia Incubación 18-24 h a 36°Cen aerobiosis
Incubar hasta 6 semanas a 36°C KoH 10% gram Ziehl-neelsen Muestra de esputo Examen directo Proceso de descontaminación Examen directo Reincubar 24 h a 36ºC el ACH Cultivo Agar Lowenstein-Jensen < 10 células epiteliales 25 PMn Positivo Identificación
negativo o flora habitual reincubar 24 h a 36°C negativo o flora habitual Prueba de
susceptibilidad Pruebas
bioquímicas
exceso de descontaminación) o a un número elevado de contaminaciones (por defecto de descontaminación).
Entre los métodos de descontaminación utilizados tenemos de naoH 4%, Petroff, Tacquet y Ticcson, Kubica modificado por Krasnow y n-acetil-L cisteína-Hidróxido Só- dico (nALC-naoH). La elección de cualquiera de estos métodos dependerá del tipo de muestras que se descontamine y, sobre todo, de la utilización de determinados medios de cultivo y realización de técnicas moleculares a partir del sedimento de las muestras descontaminadas, ya que algunos reactivos utilizados en estos métodos pueden retrasar el crecimiento de las micobacterias o interferir en las reacciones de amplificación.(14)
Todas las muestras clínicas sospechosas de contener micobacterias se deben sem- brar en medios de cultivo adecuados por las siguientes razones:
• Los cultivos son mucho más sensibles que los exámenes microscópicos, pudiendo
detectar una cantidad tan pequeña como 10 bacterias por mL de muestra clínica digerida y concentrada.
• Los aislamientos en cultivo puro son necesarios normalmente para poder identifi-
car las especies de las cepas aisladas.
• Si la baciloscopía es un índice de la eficacia del tratamiento, el cultivo permite ase-
gurar la negativización y curación del paciente.(14)
g) Identificación: de acuerdo a la correlación obtenida en el gram directo de la mues-
tra y el cultivo se procede a la identificación, realizando la selección de las pruebas de acuerdo con la orientación preliminar.
En los anexos 4, 6, 7, 14, 22, 23, 25, 26 y 27 se muestran los esquemas de identifi- cación de algunos los agentes etiológicos que causan infecciones del tracto respiratorio inferior.
Procedimiento para el cultivo de otros tipos
de muestras provenientes del tracto respiratorio inferior
a) Examen directo: se realizará la coloración de gram para el tamizaje de la muestra
al igual que el esputo, en el caso de aspirados bronquiales se usan los criterios de Murray y Washington; mientras que en las muestras obtenidas por métodos bron- coscópicos la presencia de más del 1% de células escamosas significa contamina- ción orofaríngea significativa. Además, estos especímenes no deben mostrar menos de un 10% de neutrófilos.(14)
b) Cultivo: se utilizan los mismos medios primarios que para esputo. Para estos tipos
de muestras se recomienda cultivos cuantitativos que son imprescindibles para po- der comprender el significado del o de los patógeno/s aislado/s.(14)
• Catéter telescopado: El volumen de secreciones respiratorias que se recoge con este dispositivo es de aproximadamente 0,01 a 0,001 mL. Después de obtener la muestra, el cepillo se coloca en 1 mL de suero fisiológico estéril, consiguién- dose de esta forma una solución de secreciones respiratorias diluidas entre 100 y 1.000 veces. Posteriormente, se realizará un cultivo cuantitativo de esta solu- ción. Cuando la neumonía es clínicamente manifiesta, habitualmente las secre- ciones respiratorias contienen al menos 104 UFC por gramo de tejido y 105 o más
bacterias por mililitro de exudado.(14)
• Lavado broncoalveolar (LBA): en este caso, el volumen de secreciones respi- ratorias recuperadas se estima en algo más de 1 mL diluido en el líquido que se aspira (entre 10 y 100 mL), lo que viene a suponer un factor de dilución de 1/10-1/100 de las secreciones respiratorias originales. Los puntos de corte han variado entre 103 y 105 UFC/mL. no obstante, el umbral diagnóstico general-
mente aceptado es el de 104 UFC/mL de al menos uno de los microorganismos
aislados en el cultivo.(14)
• Técnicas ciegas: en el caso del aspirado bronquial ciego y mini lavado bronco- alveolar se han considerado como significativas concentraciones entre 103 y 104
UFC/mL. Para el catéter telescopado no broncoscópico se acepta el mismo punto de corte que para el procedimiento guiado.(14)
• Aspirado endotraqueal: El umbral diagnóstico mayoritariamente aceptado es de 106 UFC/mL. Algunos autores han recomendado un valor de 105 UFC/mL como
mejor punto de corte para esta muestra.(14)
Factores a considerar en la interpretación
de los cultivos cuantitativos de muestras respiratorias
A pesar de establecer estos umbrales diagnósticos para cada una de las muestras respiratorias, la carga bacteriana debe interpretarse en el contexto clínico específico de cada paciente. no obstante, el análisis de los recuentos bacterianos requiere tener en cuenta la existencia de factores que puedan influir en la concentración de microorganis- mos en las muestras respiratorias:
1. Tiempo de evolución de la infección: Un recuento bajo de microorganismos puede representar un estadio evolutivo precoz de la infección respiratoria.
2. Antibioterapia previa: La exposición previa a antibióticos es la variable más impor- tante y la que más a menudo reduce la concentración bacteriana en las muestras
respiratorias, particularmente en pacientes que han iniciado un tratamiento anti- biótico en las 24 horas previas a la recogida de muestras.
3. Existen subgrupos de pacientes con recuentos bacterianos relativamente altos pero sin los cambios inflamatorios que definen la existencia de una neumonía, como ocurre con frecuencia en pacientes con Enfermedad Pulmonar obstructiva Crónica.
4. Variabilidad de las técnicas: Aunque la reproducibilidad cualitativa es alta, se pue- de observar una variabilidad en el recuento bacteriano que supone un cambio en la categoría diagnóstica (por encima o por debajo del punto de corte) de un 25-30%, tanto en LBA como en catéter telescopado.
5. Factor dilucional: Cambios en el volumen en el que se introduce el cepillo del ca- téter telescopado (universalmente admitido de 1 mL) pueden producir variaciones dilucionales de la muestra respiratoria recogida e influir en el recuento de colonias. En el caso del LBA el problema es mayor debido a la falta de estandarización de la técnica, en la que se usan distintos volúmenes según los autores. Se desconoce el efecto del volumen de líquido instilado y del porcentaje recuperado sobre el re- cuento bacteriano.
6. otros aspectos técnicos: Errores en la toma de muestras o retrasos en el envío de las mismas al laboratorio de microbiología pueden ser causa de descensos significati- vos en los recuentos bacterianos o de sobrecrecimientos inespecíficos.(15)
Etapa post-analítica
Una vez realizado el análisis e interpretación de los resultados, se procede al repor- te de los mismos:
a) Baciloscopía:
(-): no se encuentran BAr en 100 campos observados. (+): Menos de 1 BAr por campo en 100 campos observados. (++): 1 a 10 BAr por campo en 50 campos observados (+++): Más de 10 BAr por campo en 20 campos observados.
En caso de encontrar sólo uno a cuatro bacilos en cien campos observados debe ampliarse la lectura a otros 100 campos utilizando una nueva línea. Al examinar 200 campos y persistir el número de bacilos en 1 a 4, realizar un nuevo extendido y si per- siste el número de bacilos, reportar el número de bacilos observados y solicitar otra muestra. (11,12)