Líneas celulares y evaluación de l

Se han utilizado una gran variedad de líneas celulares, tumorales y

de platino que componen esta tesis. Las distintas características y orígenes de las líneas celulares utilizadas las describimos brevemente en la siguiente tabla:

Línea celular Características

IMR90 Fibroblastos primarios de pulmón humano no transformados.

CH1 Carcinoma de ovario humano

CH1cisR o, debida

n la reparación-tolerancia de los aductos Línea celular CH1 pero con resistencia adquirida al cisplatin

principalmente a un aumento e Pt-DNA.

Carcinoma de ovario Línea celu

combinación de una d

la reparación-tolerancia de los aductos Pt-DNA y elevados niveles de GSH.

Carcinoma de pulmón (NSCLC) Carcino

SF268 Glioblastoma (cerebro)

HCT 116 Carcinoma de colon. Líneas celulares isogénicas: p53 +/+ o -/-

CNIO-BC wt Línea primaria humana. Tumor de nervio periférico. p53 +/+

CNIO-CE wt Línea primaria humana. Rabdomiosarcoma. p53 +/+ CNIO-BP mut Línea primaria humana. Osteosarcoma. p53 -/- CNIO-BI mut Línea primaria humana. Gist. p53 -/-

CNIO-AX mut Línea primaria humana. Liposarcoma. p53 -/-

SW872 Liposarcoma humano. p53 -/-.

Tabla 2.40: Líneas celulares utilizadas.

Se han llevado a cabo dos

A2780

A2780cisR lar A2780 pero con resistencia adquirida, debida a la

isminución en la acumulación de Pt, aumento en

NCI-H460

MCF-7 ma de mama

protocolos diferentes en las distintas líneas celulares tilizadas para poder realizar una mejor selección de los complejos.

de tetrazolio MTT (brom ro de 3-[4,5-dimetildíazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio), el cual se reduce en prese

u

Uno de los protocolos utilizado es el basado en el compuesto u

ncia de las células vivas debido a la respiración oxidativa de la célula en las mitocondrias, dando lugar a una sal de formazán soluble en DMSO que se mide colorimétricamente.18 Normalmente, complejos que por el protocolo de MTT no muestran efectos biológicos a 24 horas, se consideran no citotóxicos.

Las células se plaquean en placas estériles de 96 pocillos, a una densidad de 104 células/pocillo en 100 µL de medio y se incuban 24 horas a 37 ºC en un incubador con 95%

aden los compuestos de manera que la concentración final esté comprendida de 5 y 100 µM, en un volumen de 200 µL de medio/pocillo. 24 h despu

ivientes se evalúa midiendo la absorbancia a 520 nm, usando un Whittaker Microplate Reader 2001. Los valores de IC50 se calculan a partir

de los ensayos de citotoxicidad s una adaptación del protocolo por cristal violeta usado en el NCI, cuantificándose color

na placa, se recogen justo antes de hacerse confluyentes. Se cuentan usando un hemocitómetro y se diluyen con medio de cultiv

o PBS, dependiendo de su solubilidad y estabilidad en estos disolventes, a una concentración de 10 mM o 5 mM. De aquí se prepa

de aire y 5% de CO2. A continuación se añ

és se añaden 50 µL de una disolución recién preparada de MTT en medio de cultivo (1/5). La concentración final de MTT/pocillo debe ser de 1 mg/mL. Las placas se incuban durante 5 horas a 37 ºC.

La cantidad de células superv

de graficas de células supervivientes (%) frente a concentración de compuesto. Todos los experimentos se realizan por cuadruplicado.

El protocolo utilizado por nosotros en la mayoría e

imétricamente la presencia de células viables. Las células que se encuentran creciendo en u

o para ajustar la concentración celular al número requerido de células por cada 200 µL. Las células se siembran en placas de 96 pocillos, donde se ensayan los compuestos, a una densidad dependiendo del tamaño celular entre 103 y 4·103 células/pocillo. Las células se crecen 24 horas a 37 ºC en un incubador con 95% de aire y 5% de CO2.

Los compuestos se disuelven en DMSO

ra una placa madre con disoluciones en serie de hasta 200 veces la concentración final en el cultivo. En el caso de disolverse en DMSO, la concentración final de éste en el medio de cultivo celular no debe exceder del 0.5%, debido a que comenzaría a ser tóxico para las células.

Un volumen adecuado de la disolución del compuesto (generalmente 1-2µL) se añade automáticamente (Beckman FX 96 tip) al medio hasta alcanzar la concentración final para cada droga. Cada concentración se hace por triplicado.

unda serie de pocillos control se deja con células no tratadas justo antes de la adición de las drogas (control de siemb

lino fosfato antes de ser fijadas con 10% de glutaraldehído. Las células fijadas se lavan dos veces más y se tiñen con c

Una serie de pocillos control se deja en cada placa conteniendo medio con la misma concentración de DMSO o PBS pero sin droga. Una seg

ra, número de células con las que se empieza el cultivo).

Tras una exposición a la droga durante el tiempo deseado, dependiendo del experimento, las células se lavan dos veces con un tampón sa

ristal violeta 0.5% durante 30 min. Después se lavan exhaustivamente las placas y se mide la absorbancia a 595 nm en un aparato Biorad Model 550 Microplate Reader. Los datos obtenidos de absorbancia son analizados mediante el programa GraphPad Prism 4.00 para obtener el valor de IC50 (figura 2.12).

Figura 2.12: Ejemplo de datos analizados.

-3 -2 -1 0 1 2 3 0 50 cis-DDP SF268 72 h Log[Droga] pe rv iv en ci a ce l -3 -2 -1 0 1 2 3 0 50 Log[Droga] pe rvi ven ci a ce l 100 N2 MCF-7 48h N2 MCF-7 48h 100 cis-DDP SF268 72 h % s u % s u ul ar ul ar

CH1 CH1cisR A2780 A2780cisR N2 H2N N Pt Cl O H Cl 23.4 15.8 12.4 7.5 N3 H2N N Pt Cl Cl OH 20.1 15.9 11.6 8.4 N4 N Pt Cl O H Cl H3N >100 >100 >100 >100 N5 NH3 N Pt Cl Cl OH >100 >100 >100 >100 cis-DDP Pt Cl NH₃ NH₃ Cl 6 23 2.2 38

IMR90 CH1 CH1cisR A2780 A2780cisR N2 H2N N Pt Cl O H Cl 10.8 4.7 5.4 9.4 8.3 N3 H2N N Pt Cl Cl OH 8.5 5.5 4.9 14.4 9.6 cis-DDP Pt Cl NH₃ NH₃ Cl ---a 2.1 18 0.5 13.6

NCI-H460 MCF-7 SF268