Líneas celulares y animales de experimentación

La línea celular 293FT deriva de células embrionarias primarias de riñón humano, transformadas con el antígeno T grande del virus SV40 (SV40 large T antigen). Cuando un vector de expresión viral se cotransfecta en las células 293FT se producen altos niveles de RNA viral y de proteínas Rev y Gag/Pol necesarias para el encapsulamiento viral. Estas células expresan de manera estable el gen de resistencia a neomicina del pCMVSPORT6TAg.neo y deben ser mantenidas en un medio que contenga geneticina. La expresión de este gen de resistencia está controlada por el promotor SV40. Esta línea es de crecimiento rápido y presenta una morfología epitelial y propiedades adherentes en cultivo. Fue obtenida de la compañía Life Technologies.

La línea celular murina RAW 264.7 proviene de macrófagos murinos transformados con virus de leucemia murina de Abelson. Fue proporcionada por el laboratorio del Dr. Andrés Alonso (Instituto de Biología y Genética Molecular, Valladolid). Esta línea celular es fácil de cultivar, de alta eficiencia para la transfección de DNA, y sensible a la interferencia RNA. Las células tienen los receptores para la inmunoglobulina (FcRs) y complemento, y producen lisozima. Se utilizan en estudios metabólicos, de inflamación y apoptosis, entre otros, y para el estudio de la internalización y supervivencia de bacterias. Estas características hacen que sea una línea celular adecuada para el estudio de la fagocitosis.

Los macrófagos peritoneales de ratones C57BL/6J de tipo salvaje (WT) y deficientes en la proteína FASTK (KO), se obtuvieron tal y como se detalla en el apartado número 6 de Material y Métodos. Los ratones fueron alimentados y mantenidos en jaulas estériles en una habitación del animalario de la Facultad de Medicina de Valladolid con un ciclo de luz/oscuridad estándar (12 horas de luz/12 horas de oscuridad). Los ratones utilizados en el estudio fueron de 8 a 12 semanas de edad con un promedio de peso de 18-20 g. Todos los experimentos se llevaron a cabo tras la aprobación del Comité de Ética en Experimentación y Bienestar Animal (CEEBA) de la Universidad de Valladolid. Los ratones deficientes de la proteína FASTK (KO) fueron generados previamente en el laboratorio (Simarro et al., 2010b).

Las líneas celulares y los macrófagos peritoneales murinos fueron cultivados en medio de cultivo DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) (LONZA) suplementado con 10 % de suero fetal bovino (FBS, Fetal Bovine Serum) (LONZA) inactivado por calor,

La línea 293FT fue cultivada en medio completo al que se le añadió 1 % de aminoácidos no esenciales (NEAA, Non-Essential Amino Acid) (Gibco) y geneticina a una concentración de 500 µg/ml (Gibco).

Las condiciones estándares de cultivo para todas las líneas celulares son de 37ºC en atmósfera con 5 % de CO2.

La viabilidad celular se evaluó por exclusión con azul de tripán al 0.4 % (Gibco) y las células se contaron con la cámara de Neubauer utilizando el microscopio óptico.

2. Cepas bacterianas

• Escherichia coli DH5a, esta cepa bacteriana se obtuvo de Invitrogen (LifeTechnologies, Carlsbad, CA). Su genotipo es λ–F– Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rK–, mK+) phoA supE44 λ– thi- 1 gyrA96 relA1.

• Staphylococcus aureus Cowan 1, esta cepa bacteriana se obtuvo de la American Type Culture Collection (número de identificación ATCC 12598). • Escherichia coli (DH5-alpha) y Staphylococcus aureus recombinante. Se

obtuvieron introduciendo un plásmido pUC que lleva el gen de la proteína verde fluorescente o GFP (Green Fluorescence Protein) (resistente a cloranfenicol) en una bacteria competente. El plásmido fue proporcionado por el laboratorio de la Dra. Ana Abadía Molina (Universidad de Granada).

3. Plásmidos

Plásmido pGreen Puro: es un vector lentiviral de tercera generación derivado del HIV (Human Immunodeficiency Virus), de 7.861 bp. Se ha obtenido de System Biosciences. Se caracteriza por un casete génico de expresión de H1 que permite la transcripción constitutiva y eficiente por RNA polimerasa III de tránscritos de shRNA (short hairpain RNA) en una gama amplia de líneas celulares. También tiene un promotor CMV que permite niveles altos de expresión tanto del gen copGFP como del gen de resistencia a la puromicina (Figura 14) que codifica la enzima N-acetil transferasa para seleccionar las células cuya transfección haya sido satisfactoria. Y contiene también un promotor híbrido de RSV-5’LTR que proporciona niveles de expresión altos del constructo viral en las células 293FT, y se requiere para el empaquetamiento viral y la transcripción. Este vector necesita elementos genéticos para el empaquetamiento, la transducción y la integración estable en el genoma del huésped. Además, contiene un gen de resistencia a la ampicilina para su amplificación en bacterias.

Figura 14. Mapa y características del vector (RSV/5’LTR, promotor; gag, señal de empaquetamiento; cPPT; promotor CMV; copGFP; T2A; Puro; WPRE; 3’DLTR; promotor H1 RNA; SV40 Poly-A, SV40 Ori, pUC Ori, AmpR).

Plásmido pMD2.G: es un plásmido de 5.824 bp, que se utiliza en la producción de lentivirus ya que posee un gen que codifica para la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular, VSV-G (Vesicular Stomatitis Virus Glycoprotein), una proteína involucrada en la formación de la envoltura viral. Además, posee un casete de resistencia a ampicilina que permite su selección para propagación en bacterias (Figura 15). Este plásmido fue desarrollado por el laboratorio del Dr. Didier Trono y obtenido de Addgene (Addgene plasmid #12259).

β-globina de conejo que aumenta la eficiencia en la expresión de las proteínas de Gag, Pol, Tat y Rev del HIV-1, que también son codificadas por este plásmido y son necesarias para que se produzca el empaquetamiento de los lentivirus (Figura 16). Este plásmido fue desarrollado por el laboratorio del Dr. Didier Trono y obtenido de Addgene (Addgene plasmid #12260).

Figura 16.Representación del vector psPAX2.

Plásmido pDsRed1-RFP N1: es un vector de 4.7 kb, que codifica una proteína fluorescente roja (RFP). Esta proteína RFP se aisló de una anémona de mar Discosoma sp. El MCS (Multiple Cloning Site) se encuentra entre el promotor temprano inmediato de CMV y la codificación de la secuencia DsRed1. El vector tiene un casete de resistencia a la neomicina, lo que permite que las células eucariotas transfectadas de manera estable se seleccionen utilizando geneticina, y un casete que confiere resistencia a la kanamicina (30 µg/ml) para su amplificación en E.coli. Este plásmido fue cedido por la Dra. Nancy Kedersha (Universidad de Harvard, Boston, MA).

4. Oligonucleótidos

· Oligonucleótidos para la clonación en el vector pGreenPuro:

Los oligonucleótidos diseñados para la clonación en el vector pGreenPuro se representan en la tabla 6. Se utilizaron las enzimas de restricción BamHI y EcoRI. Los genes de interés utilizados para la interferencia de RNA en el presente estudio de investigación se especifican en la tabla 6, y el número de acceso a la secuencia asignada (Refseq) en los registros de secuencia de NCBI Reference Sequence (Refseq) fueron los siguientes: FASTK mouse (número de acceso Refseq NM_023229,

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_023229), NDUFS4 mouse (número de acceso Refseq NM_010887, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_010887),

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_026688) y para 5’UTR Fastk (número de acceso Refseq NM_023229, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_023229). Tabla 6.Oligonucleótidos diseñados para la clonación en el vector pGreenPuro. En la tercera columna se representa en negrita la secuencia diana (target sequence).

· Oligonucleótidos para el screening de pGreenPuro:

Con los oligonucleótidos que se representan en la tabla 7 se comprobó que el inserto se había incorporado en el vector pGreenPuro.

Tabla 7. Oligonucleótidos utilizados para secuenciar por PCR.

· Oligonucleótidos para qRT-PCR:

En la tabla 8 se indican las secuencias de los genes FASTK, NDUFS3 y NDUFS4, y de los genes normalizadores b-actina y 18S utilizados como control (housekeeping). El número de acceso a la secuencia asignada (Refseq) en los registros de secuencia de NCBI Reference Sequence (Refseq) para los genes b-actina y 18S fueron los siguientes: b-actina mouse (número de acceso Refseq NM_007393,

Tabla 8. Oligonucleótidos empleados para realizar la amplificación mediante qRT-PCR en las células RAW 264.7 transfectadas.