I. - INTRODUCCIÓN
A) ESPECTROFOTOMETRIA:
Utilizando términos quizás excesivamente simplistas puede definirse la espectrofotometría de absorción, como la medida de la atenuación que el material a estudiar (muestra) efectúa sobre una radiación incidente sobre el mismo con un espectro definido. En general, las medidas se realizan dentro del espectro comprendido entre 220 y 800 nm, y este espectro, a su vez, puede dividirse en dos amplias zonas: la zona de la radiación visible, situada por encima de 380 nm, y la zona de la radiación
ultravioleta situada por debajo de estos 380 nm. La región del infrarrojo se sitúa por encima de los 800
nm.
La energía de una onda electromagnética está dada por la ecuación: E = hν, donde h es la constante de Planck y v es el número de onda (el recíproco de la longitud de onda λ).
La energía de la luz UV y visible es capaz de excitar electrones π y electrones no enlazantes desde su estado basal a un nivel energético mayor (estado excitado) y, en consecuencia, se dice que la molécula que contiene estos electrones absorbe luz a la longitud de onda correspondiente. Generalmente, este tipo de electrones se encuentran en moléculas conjugadas (moléculas que poseen dobles enlaces separados por un enlace simple). La conjugación aumenta la longitud de onda de la absorción al disminuir la diferencia energética entre el estado basal y el estado excitado, de modo que un dieno conjugado absorbe luz de alrededor de 215 nm, mientras que un compuesto con un alto número de enlaces conjugados, como el β-caroteno absorbe a 450 nm. La estructura de enlaces conjugados que permite la absorción de luz se denomina cromóforo.
Si una luz blanca pasa a través de una solución que contiene compuestos que actúan como cromóforos, ciertas longitudes de onda son absorbidas selectivamente. El color resultante de la solución se debe a la luz transmitida.
La absorción de luz por parte de una sustancia es una propiedad característica de ella, que puede ser utilizada para su identificación y cuantificación, ya que un compuesto determinado tiene un espectro de absorción característico, por lo tanto la comparación del espectro de este compuesto puro con los espectros de compuestos conocidos permitirá su identificación.
Leyes de la absorción de energía radiante
Se refieren a las relaciones existentes entre la cantidad de absorbente y el grado con el que es absorbida la energía radiante. En términos generales, puede decirse que hay dos variables capaces de afectar al grado de absorción: la concentración del absorbente y la longitud del trayecto que el rayo luminoso recorre a través de la solución.
La Ley de Lambert - Beer establece que la absorción es proporcional al número de moléculas de la
sustancia absorbente presente en la solución por donde pasa el haz electromagnético. La expresión matemática para esta ley es:
A = ε l c
Donde ε es la “absortividad molar” (una medida de la radiación absorbida), que es un valor constante para cada sustancia a cada longitud de onda λ. Cuando la concentración, c, es expresada en moles por litro se denomina “coeficiente de extinción molar” y cuando es expresada en gramos por litro “coeficiente de extinción específico”. El término “l” representa el espesor de la capa absorbente y está en unidades de cm.
Cuando las medidas se efectúan utilizando siempre la misma cubeta (o bien un grupo de cubetas estandarizadas que posean un paso de luz constante) y los efectos ópticos debidos a la cubeta son reproducibles, el término “l” de la expresión de la absorbancia se hace constante. Dado que ε, es también constante para un determinado absorbente y una concreta longitud de onda, resulta entonces que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración:
A = k c (k = ε l).
La absorbancia es adimensional, presenta valores entre 0 y 2 unidades de absorbancia o densidad óptica, dentro de cuyo rango generalmente se cumple la Ley de Lambert - Beer
Características de un espectrofotómetro
La medida de absorbancia se lleva a cabo con la ayuda de un espectrofotómetro:
Estos equipos contienen los siguientes componentes básicos:
Posee una fuente de luz capaz de emitir luz a las longitudes de onda que se quiere medir. El selector de longitud de onda permite el paso de la luz a la longitud de onda deseada. Una rendija u orificio define la intensidad de luz incidente sobre la muestra dispuesta en una celda o cubeta que posee un diámetro de 1 cm y no interfiere con el paso de la luz, y finalmente, la luz emitida después de su paso por la celda es cuantificada por un detector.
Los espectrofotómetros dan la lectura directa de la absorbancia (A) o bien, el porcentaje de transmitancia (%T). La relación entre ambos es:
A = 2 - log % T
La ventaja fundamental que ofrece el empleo de la Absorbancia en lugar de la Transmitancia es que la relación existente entre la concentración y la absorbancia es lineal, cosa que no sucede con el %T.
100 80 % 60 Absorbancia Transmitancia 40 20 concentración (g/l) concentración (g/l)
La absorbancia de una solución es la resultante de la absorbancia del soluto cuya concentración se desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos) que absorben también a esa longitud de onda. Estos compuestos se denominan interferencias. Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga todos los componentes del sistema menos aquel que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia de éste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien, con el blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0, o sea 100% de transmisión.
Curvas de calibración
Una curva de calibración relaciona las A ó %T con las concentraciones y su empleo es necesario en los trabajos cuantitativos en los que hay que calcular la concentración del absorbente. Siempre que sea posible, es aconsejable la construcción de una curva de calibración que cubra la zona de concentraciones que se van a encontrar en la práctica.
La elaboración de la curva debe ser la fase primera al montar y estandarizar cualquier procedimiento fotométrico. Las concentraciones pueden expresarse en cualquier tipo de unidades de medida; sin embargo, la medida más conveniente es emplear para las curvas las mismas unidades en las que se debe expresar el resultado final.
B) ENZIMAS:
La mayoría de las reacciones químicas que ocurren en los sistemas vivos, si siguieran sus propios mecanismos, ocurrirían demasiado lentas. Se requiere de catalizadores para que estas reacciones transcurran a velocidades que realmente sean útiles para la célula. En los sistemas biológicos, los catalizadores de dichas reacciones químicas son las enzimas.
¿Qué es catálisis? ¿Qué es lo que hace la catálisis? Para entenderlo, consideremos una reacción química simple:
A + B C + D
Si la reacción ocurre sin interferencia, eventualmente, parecerá como si se detuviera. Lo que sucede realmente es que tanto la reacción directa como la inversa están ocurriendo a la misma velocidad. Esto es lo que conocemos como equilibrioquímico y podemos expresar su constante de equilibrio:
Esta constante es característica de la reacción. Un catalizador aumenta la velocidad a la que la reacción se acerca al equilibrio, pero no altera la naturaleza del estado de equilibrio. Otra propiedad importante de los catalizadores es que son muy efectivos en cantidades muy pequeñas, con respecto a las cantidades a catalizar.
La Cinética Enzimática, es una rama especializada de la cinética química, que está basada en la
teoría cinética de la materia. En esta teoría, se ve que una solución está hecha de un grupo de moléculas y que cada una de ellas se mueve a una velocidad particular. En este movimiento, ellas chocan entre sí, cada colisión involucra una cierta cantidad de energía. Si la colisión no involucra suficiente energía, la reacción no ocurre. Si la energía es suficiente, las moléculas se combinan para formar un intermediario activado, estableciendo un estado de transición. La energía mínima que se requiere para la formación de este intermediario es la Energía de Activación. Esto lo podemos representar mediante: