Les unions estretes

En els vasos sanguinis cerebrals, les TJ són les principals estructures que limiten el pas de substàncies via paracel·lular a través de la paret dels capil·lars. Les TJ es troben entre les CECC i les encerclen formant un cinturó continu (Bernacki i col., 2008). Degut a això, la via paracel·lular queda pràcticament segellada (Grieb i col., 1985; Mitic i Anderson, 1998). El nombre de punts de fusió entre les TJ pot variar segons la regió cerebral, fet que genera un nivell de hermeticitat no homogeni en les diferents zones del cervell. Així, a mesura que els capil·lars es transformen en vènules postcapil·lars s’observa un segellat menor (Simionescu i col., 1976). Moltes de les característiques i propietats especials de les TJ es coneixen gràcies a estudis fets amb cèl·lules epitelials en cultiu (Sandoval i Witt, 2008). Les TJ determinen una alta resistència elèctrica de la capa endotelial (1500-2), i la seva integritat depèn d'una adequada concentració extracel·lular d'ions Ca2+. A més a més, un

augment de la concentració d’ATP intracel·lular genera nous punts de fusió que enforteixen les TJ (Bernacki i col., 2008).

Diverses proteïnes de la membrana plasmàtica han estat identificades com a constituents de les TJ (Figura 17a). Entre aquestes es troben la claudina, l’ocludina i les Junctional adhesion molecules(JAM). A més a més, les proteïnes ZO (Zonula occludens) 1, 2 i 3 juntament amb la cingulina, han estat identificades com a proteïnes citoplasmàtiques que uneixen les proteïnes de les TJ amb l'actina, que és una proteïna del citoesquelet de les cèl·lules que té un paper determinant en el manteniment de la integritat estructural i funcional de l'endoteli (Ballabh i col., 2004).

Figura 17a.Esquema de les TJ interendotelials (Modificat de Sandoval i Witt, 2008)

3.1.1.1. Ocludina.

L’ocludina és una fosfoproteïna de 60-65 kDa amb 4 dominis transmembrana que es troba a concentracions altes a les TJ (Figura 17a) i s’expressa en una àmplia varietat de teixits, als que sembla que confereix propietats de barrera. La proteïna forma dos bucles extracel·lulars separats per un bucle petit citosòlic, i els seus extrems amino i carboxílic estan situats ambdós al citosol. A les TJ, les molècules d’ocludina formen dímers que interaccionen homofílicament (Feldman i col., 2005). La regió carboxiterminal de l’ocludina, que codifica per un domini putatiu en espiral-espiral, es pot enllaçar amb diverses proteïnes que

(Sandoval i Witt, 2008). Estudis fets amb ratolins als que se’ls va eliminar l’ocludina van mostrar que els animals presentaven un retard del creixement acompanyat d’un fenotip complex (Saitou i col., 2000). Sorprenentment, les TJ no es veien afectades per la seva absència, i les mesures de resistència elèctrica transepitelial van donar valors normals. De tota manera, els animals presentaven hiperplàsia de l’epiteli gàstric, calcificacions al cervell i atròfia dels testicles, la qual cosa fa pensar que l’ocludina desenvolupa funcions importants a nivell fisiològic més enllà de formar part de les TJ.

S’ha proposat que l'estat de fosforilació de l’ocludina és un factor determinant en la regulació de la funció de les TJ (Feldman i col., 2005). La forma altament fosforilada de la proteïna es concentra a la membrana cel·lular i les TJ de les que forma part s’identifiquen com a intactes, mentre que la forma menys fosforilada es troba bàsicament a la fracció citoplasmàtica i es pensa que podria servir com a reservori de la proteïna (Sakakibara i col., 1997; Wong, 1997). L’ocludina que es troba a la membrana cel·lular té les serines i treonines fosforilades (Andreeva i col., 2001), mentre que la fosforilació de les seves tirosines s'ha identificat amb la seva desvinculació de les proteïnes intracel·lulars (ZO-1, ZO-2 i ZO-3) i amb l’augment de la permeabilitat de les TJ (Kago i col., 2006; Kale i col., 2003). No obstant això, existeix certa discrepància en els papers que pot tenir la fosforilació de l’ocludina a cada tipus concret de cèl·lula i davant de diferents estímuls (Sandoval i Witt, 2008).

3.1.1.2. Claudines.

Les claudines són una família de proteïnes que contribueixen a la formació de les TJ i inclouen, com a mínim, 24 membres. Les claudines tenen dos bucles extracel·lulars que s’uneixen amb els de les claudines de les CECC adjacents, formant d’aquesta manera la junta principal de les TJ (Piontek i col., 2008). Són més petites que les ocludines (20 - 24 kDa), i no presenten seqüències homòlogues amb aquestes. Les claudines s’uneixen a les proteïnes ZO mitjançant els seu extrem carboxiterminal (Itoh i col., 1999). D’entre tots els membres de la família, les claudines 3, 5 i 12 s’han detectat a les CECC de la BHE, mentre que hi ha controvèrsia respecte a la presència de la 1 (Zlokovic, 2008) (Figura 17a). Diversos estudis indiquen que la claudina-5 està especialment implicada en la regulació de la permeabilitat a molècules petites de la BHE. S’ha vist que els fàrmacs que augmenten l’expressió de claudina-5 incrementen la resistència transendotelial, disminuint per tant la permeabilitat de la BHE (Honda i col., 2006). A més a més, els ratolins sense el gen que codifica la claudina-5 tenen la integritat de la BHE compromesa, ja que s’ha observat que hi ha un augment al cervell de la captació de molècules menors de 800 Da (Nitta i col., 2003). Sembla que l’activitat de les claudines està regulada per fosforilació, donat que la fosforilació

del seu residu Thr207 mediada per la PKA o la Rho quinasa activa indueix un augment de la permeabilitat de les TJ (Sandoval i Witt, 2008).

3.1.1.3. JAM.

Les JAM són una família de proteïnes de 40 kDa que s’inclouen dins de la superfamília de les immunoglobulines. Les JAM es localitzen a les TJ, i també s'expressen en leucòcits i plaquetes (Bernacki i col., 2008). Les JAM participen en l’acoblament i el manteniment de les TJ, en la senyalització de proteïnes associades al citoesquelet i en la diapedesi dels leucòcits (Weber i col., 2007). S’han identificat vàries JAM: JAM-A (també coneguda com JAM, JAM-1, F11R), JAM-B (també coneguda com JAM-2, JAM-2 humana, JAM-3 de ratolí, VE-JAM), JAM-C (també coneguda com JAM-3, JAM-3 humana, JAM-2 de ratolí), i més recentment JAM-4 i JAML (JAM-like o AMICA1) (Sandoval i Witt, 2008). Les JAM tenen un únic domini transmembrana i el seu segment extracel·lular té dos bucles de tipus immunoglobulina formats per ponts disulfur. A nivell d’interaccions intercel·lulars, es pensa que les JAM les poden establir tan homofíliques com heterofíliques (Weber i col., 2007). Al citoplasma, les JAM s’uneixen principalment a les proteïnes intracel·lulars ZO-1, afadina (AF-6), la proteïna de partició defectuosa-3 (PAR-3) i la multiproteïna-PDZ-1 (MUPP-1) (Ebnet i col., 2003). A les CECC s’ha detectat l’expressió de JAM-A, B, i C, essent la JAM-A la més altament expressada en la vasculatura cerebral. A més a més, també s’ha demostrat que les interaccions homofíliques de JAM-A estabilitzen les TJ i disminueixen la permeabilitat intestinal (Liu i col., 2000; Mandell i col., 2004). Coincidint amb aquestes observacions, s’ha trobat que la pèrdua de la integritat de la BHE deguda a una alteració de les TJ es correlaciona amb una disminució de l’expressió de JAM-A (Yeung i col., 2008).

3.1.1.4. Proteïnes citoplasmàtiques accessòries.

Diverses proteïnes citoplasmàtiques participen en la formació i la regulació de les TJ. Aquestes són la ZO-1, la ZO-2, la cingulina, la 7H6, i l’AF-6 (Hawkins i Davis, 2005), encara que probablement n’hi pugui haver d’altres. La ZO-1 (220 kDa) i la ZO-2 (160 kDa) són fosfoproteïnes de la família de proteïnes guanilil-quinase-like associades a membrana i que tenen la capacitat de formar complexos heterodimèrics l’una amb l'altra. Les ZO contenen tres dominis PDZ (PDZ1, PDZ2 i PDZ3), un domini SH3 i un domini guanilil-quinase-like. Aquests dominis actuen com regions d’unió a molècules, facilitant així l'organització de les

una funció redundant a la de la ZO-1, substituint-la i contribuint a la formació de TJ més competents i estables (Umeda i col., 2004). El fragment carboxiterminal ric en prolina de les ZO es creu que serveix d'enllaç entre les TJ i el citoesquelet d'actina de les CECC (Fanning i col., 1998). D'aquesta manera, les proteïnes ZO funcionen com a proteïnes de reconeixement que faciliten la ubicació i la unió de les proteïnes transmembrana de les TJ al citoesquelet d’actina de les CECC (Sandoval i Witt, 2008).

S’han identificat altres proteïnes accessòries de les TJ, tot i que encara queden per aclarir alguns aspectes de les seves funcions estructurals i reguladores. La cingulina és una fosfoproteïna de 140-160 kDa localitzada a la superfície citoplasmàtica de les TJ que s'uneix a les proteïnes ZO, la miosina, la JAM-A, i l’AF-6 (Cordenonsi i col., 1999; Bazzoni i col., 2000), de manera que té una funció destacada com a proteïna d’ancoratge. També s’ha suggerit que la cingulina transmet la força mecànica generada per la contracció de l’actina i la miosina del citoesquelet, regulant així la permeabilitat de les TJ (Cordenonsi i col., 1999). La fosfoproteïna 7H6 (155 kDa) es dissocia de forma reversible de les TJ quan hi ha nivells baixos d’ATP, fet que va associat a un augment de la permeabilitat paracel·lular (Zhong i col., 1994; Satoh i col., 1996). Finalment, l'AF-6, de 180 kDa, s’ha vist que interacciona amb la ZO-1 a les TJ (Yamamoto i col., 1999).

3.1.1.5. Actina.

Tot i que l’actina (42 kDa) no és pròpiament una proteïna de les TJ, té un paper actiu en la seva regulació i estabilització (Lai i col., 2005). La forma lliure de la proteïna, que té una estructura globular, polimeritza en una forma filamentosa que s’anomena F-actina, en un procés que requereix ATP. Aquests filaments de F-actina proporcionen la infraestructura necessària per al manteniment de la morfologia i la funció de la cèl·lula. A més a més, a les CECC es detecta una banda prominent de F-actina a la part apical de la cèl·lula que serveix per fixar la disposició espacial de les proteïnes que formen les TJ. La importància del citoesquelet per a l'establiment i el manteniment de la BHE es va fer evident a partir d'estudis en ratolins MDX, als quals els manca la distrofina, que és una proteïna que s’uneix a l’actina. Aquests ratolins presenten un augment de la permeabilitat vascular cerebral deguda a la desorganització del citoesquelet de les CECC i dels astròcits, així com una alteració de la localització subcel·lular de les proteïnes de les TJ de les CECC i del canal d’aigua aquaporina-4 dels processos pediculars dels astròcits (Nico i col., 2003). Aquestes observacions demostren que l’organització dels filaments d’actina i la seva unió a les proteïnes de les TJ són un factor crític per a la correcta funció de la BHE.