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E. U.U Tabla M.2: Otros reactivos utilizados
1. El linaje del NB 3-5 como sistema modelo
1.1. El estudio de la especificación neural requiere marcadores de
identidad celular
Para estudiar los mecanismos de especificación neural se requieren marcadores que permitan identi- ficar los diferentes destinos neurales existentes. En el SNC, cada hemisegmento está formado por un importante número de células con identidades únicas, contrariamente a lo que sucede otros tejidos, donde las células con una misma identidad se agrupan formando territorios. Es necesario disponer de marcadores que permitan distinguir estos destinos individuales para que la interpretación de los fenotipos generados por los distintos genotipos mutantes sea resolutiva.
En un intento por solventar esta carencia, distintos laboratorios están generado conjunta- mente una colección de líneas de moscas transgénicas portadoras de las zonas reguladoras de todos los genes con expresión conocida en el SNC. Cada línea tienen integrado en su genoma un vector Gal4 que contiene una región de ADN genómico de no más de 3kb correspondiente a una putativa región reguladora. El objetivo final de este proyecto es producir una colección de líneas Gal4 con dominios de expresión restringidos y de esta forma poder manipular e identificar tipos celulares indi- viduales o grupos funcionales en el SNC Drosophila melanogaster (Pfeiffer et al., 2008) (Jenett et al., 2012; Li et al., 2014; Manning et al., 2012).
Paralelamente, el grupo de C.Q.Doe ha desarrollado un programa informático capaz de in- tegrar múltiples patrones de expresión, estudiar su relación, comparar con bases de datos existentes y realizar reconstrucciones en 3D. Además, este programa permite ser actualizado por el usuario (Heckscher et al., 2014). A modo de prueba, los autores han generado un altas de SNC de embrión tardío basado en 8 factores de transcripción y 75 líneas Gal4. Siguiendo esta metodología han mar- cado el 60% de las interneuronas presentes de un hemisegmento.
1.2. Los marcadores celulares de linaje
Una estrategia complementaria para identificar destinos celulares en el SNC son los marcadores de linajes: genes que se expresan en uno o varios NBs así como en su progenie. Estos marcadores permi- ten visualizar el linaje de un NB diferenciándolo del resto de células del SNC.
En la CNV de Drosophila melanogaster se han identificado varios marcadores de linaje. Por una parte, el gen gsb se expresa en los NBs de la fila 5, 6 y dos NBs de la fila 7 (NB 7-1 y NB 7-3), así como en su progenie (Buenzow and Holmgren, 1995). Sin embargo, la proximidad de los NBs que expresan este gen impide que sus linajes sean identificados de manera individual. Para solventar este problema es posible utilizar un segundo marcador de forma que la combinación de ambos marcado- res se produzca en un único NB. Siguiendo esta estrategia y utilizando la expresión conjunta de gsb
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y de acheate con el sistema Split-Gal4 (Luan et al., 2006b), Kohwi et al. marcaron el linaje del NB 7-1 (Kohwi et al., 2013). Por otra parte, la expresión del gen eg en un número restringido de NBs ha permitido la descripción detallada de los linajes de los NBs 3-3 (Tsuji et al., 2008) y 7-3 (Karcavich and Doe, 2005). Por último, la expresión de ladybird (ldb) en el NB 5-6 ha sido clave para el análisis de todo su linaje (Baumgardt et al., 2009).
1.3. El linaje temprano del NB 3-5
A pesar de los avances realizados, solo se conoce los linajes completos de 3 de los 30 NBs que dela- minan en un hemisegmento, el NB 3-3 (Tsuji et al., 2008), el NB 7-3 (Karcavich and Doe, 2005) y el NB 5-6 (Baumgardt et al., 2009). En este trabajo, gracias a la expresión de Ems hemos estudiamos la progenie del NB 3-5. Este NB delamina en el estadio 8 y genera el linaje esquematizado en la figR.5E.
Los linajes de los NB 3-5 y 5-6 (Baumgardt et al., 2009) presentan varias similitudes. Por una parte, ambos NBs se generan en la primera ola de delaminación y comienzan su programa de desarrollo por la ventana temporal Hb. Además, las dos primeras células originadas tanto por el NB 5-6 como por el NB 3-5 expresan Hb, Kr y Pdm. Pdm se expresa en el NE durante las primeras olas de delaminación por lo que la mayor parte de células generadas tempranamente en el SNC heredan su expresión (Dick et al., 1991; Kambadur et al., 1998). No obstante también existen diferencias entre los linajes de estos dos NBs. Un ejemplo es la duración de la ventana Hb: mientras que el NB 3-5 solo genera 2 CMGs Hb positivas, el NB 5-6 da lugar a 3 CMGs durante la primera ventana temporal. Este dato junto a los experimentos de transplante y cultivo in vitro de NBs (Brody and Odenwald, 2000; Huff et al., 1989; Luer and Technau, 2009), ponen de manifiesto que la duración de las ventanas temporales se regula de forma autónoma en cada linaje.
El linaje del NB 3-5 presenta ciertas ventajas para su utilización como sistema modelo. El NB 3-5 delamina en el estadio 8 por lo que se puede identificar y manipular con relativa facilidad. Ade- más, este NB genera un importante número de células (entre 25-30) (Schmid et al., 1999; Schmidt et al., 1997). Por lo tanto, su programa de desarrollo debe contener diversos mecanismos de especi- ficación. Por último, la descripción del linaje temprano del NB 3-5 realizada en este trabajo permite relacionar dos destinos neuronales diferenciados (CCAP-NEs y CCAP-INs), identificables por la expresión de dos neuropéptidos, con los procesos de especificación que suceden tempranamente en el embrión.
Sin embargo, trabajar con el linaje del NB 3-5 como modelo conlleva ciertas limitaciones todavía no resueltas. Por un lado, las herramientas disponibles solo permiten identificar linaje del NB 3-5 hasta estadio 11, ya que como se ha señalado previamente, a partir de este estadio ems también se expresa en el NB3-3 y el NB4-4. Una manera de resolver esta cuestión es tratar de aislar la región reguladora que dirige la expresión de ems específicamente en el NB 3-5. Esta misma aproximación
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se utilizó con éxito para restringir la expresión de ldb al NB 5-6 (De Graeve et al., 2004). Por otro lado, actualmente solo los genes temporales nos permiten caracterizar la progenie del NB 3-5 ya que salvo ems, ninguno de los genes identificados se expresan tempranamente en el linaje. Por lo tanto, un objetivo futuro es encontrar marcadores que nos permitan identificar las diferentes células del linaje en estadios tempranos del desarrollo.