Los genes ntr y cnb de T rangeli se expresan a nivel de ARNm

La estrategia de amplificación de los transcritos ntr y cnb por RT-PCR permitió confirmar la expresión de los mismos en epimastigotes de T. rangeli Tre, adicionalmente, el uso el iniciador SLTc/Tr resultó en la obtención de la secuencia de

de transcrito generado tanto para T. rangeli Tre como para T. cruzi 058PUJ a partir de la secuenciación de los productos.

6.3.1 ntr T. rangeli Tre

Se obtuvo un producto de 686 pb (Figura 41) que contenía el Spliced leader, la región 5´UTR del transcrito y 434 pb de región codificante del gen al 5´.

Figura 41. Amplificación de la 5´UTR del gen ntr de T. rangeli Tre SLTc/Tr-NTRTr/430Rw.

Electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio conteniendo 125µl del producto de amplificación. ADNc de la cepa Tre de T. rangeli (Tr); Control negativo de la PCR con agua destilada

(CN). Se usó 1Kb plus (Invitrogen) como marcador de peso molecular (M) cuyos pesos se indican a la izquierda.

Posteriormente, el producto fue clonado y secuenciado (Figura 42). Dicha secuencia permitió obtener además la bases faltantes al 5´ del gen ntr para concluir que la región codificante completa posee 895 pb.

Figura 42. Secuencia 5´UTR ntr de T. rangeli Tre. Los números a la izquierda indican la posición de nucleótidos en la secuencia, en negrita se señala la secuencia del SL común a todos los transcritos de T. cruzi y T. rangeli.

El modelo de la figura 43 ilustra la estructura parcial del transcrito según los resultados presentados:

Figura 40. Modelo de transcrito ntr de T. rangeli Tre. Se señala la secuencia del Spliced leader en rojo (39 pb), la 5´UTR en verde y la región codificante en azul. Se muestra la posición y dirección de los iniciadores utilizados.

6.3.2 ntr T. cruzi 058PUJ

Se obtuvo un producto de 1119 pb (Figura 44) que contenía el Spliced leader, la región 5´UTR del transcrito y la región codificante completa del gen.

Figura 44. Amplificación de la 5´UTR del gen ntr de T. cruzi 058PUJ utilizando los iniciadores SLTc/Tr y NTR-RW. Electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio conteniendo 15µl del producto de amplificación. Control negativo de la PCR (CN); ADNc del aislado 058PUJ de T. cruzi (Tc); Se usó 1Kb plus (Invitrogen) como marcador de peso molecular (MW) cuyos pesos se indican a la derecha.

Posteriormente, el producto fue clonado y secuenciado (Figura 45). Dicha secuencia permitió obtener además la bases faltantes al 5´ del gen ntr para concluir que la región codificante completa posee 945 pb.

Figura 45. Secuencia 5´UTR ntr de T. cruzi 058PUJ. Los números a la izquierda indican la posición de nucleótidos en la secuencia, en negrita se señala la secuencia del SL común a todos los transcritos de T. cruzi y T. rangeli

El modelo de la figura 46 ilustra la estructura parcial del transcrito según los resultados presentados:

Figura 46. Modelo de transcrito ntr de T. cruzi 058PUJ. Se señala la secuencia del Spliced leader en rojo (39 pb), la 5´UTR en verde y la región codificante en azul. Se muestra la posición y dirección de los iniciadores utilizados.

Por último, cabe resaltar que la secuencia 5´UTR de T. rangeli Tre presenta una identidad del 49,8% con la UTR obtenida para T. cruzi 058PUJ.

6.3.3 cnb T. rangeli Tre

Se obtuvo un producto de 682 pb (Figura 47) que contenía el Spliced leader, la región 5´UTR del transcrito y la región codificante completa del transcrito.

Figura 47. Amplificación de la 5´UTR de cnb de T. rangeli Tre utilizando los iniciadores SLTc/Tr- CaNB-TAG. Electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio conteniendo 25µl del producto de amplificación. ADNc de la cepa Tre de T. rangeli (Tr); Control negativo de la PCR con agua

destilada (CN) . Se usó 1Kb plus (Invitrogen) como marcador de peso molecular, cuyos pesos se indican a la izquierda.

El producto fue clonado y secuenciado (Figura 48).

Figura 48. Secuencia 5´UTR cnb de T. rangeli Tre. Los números a la izquierda indican la posición de nucleótidos en la secuencia, en negrita se señala la secuencia del SL común a todos los transcritos de T. cruzi y T. rangeli.

El modelo de la figura 49 ilustra la estructura parcial del transcrito según los resultados presentados:

Figura 49. Modelo de transcrito cnb de T. rangeli Tre. Se señala la secuencia del Spliced leader en rojo (39 pb), la 5´UTR en verde y la región codificante en azul. Se muestra la posición y dirección de los iniciadores utilizados.

6.3.4 cnb T. cruzi 058PUJ

Se obtuvo un producto de 707 pb (Figura 50) que contenía el Spliced leader, la región 5´UTR del transcrito y la región codificante completa del mismo.

Figura 50. Amplificación de la 5´UTR de cnb de T. cruzi 058PUJ utilizando los iniciadores SLTc/Tr-CalB-RW. Electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio conteniendo 25µl del producto de amplificación. ADNc del aislado 058PUJ de T. cruzi (Tc); Control negativo de la PCR con agua destilada (CN). Se usó 1Kb plus (Invitrogen) como marcador de peso molecular (MW)., cuyos pesos se indican a la izquierda.

El producto fue clonado y secuenciado (Figura 51).

Figura 51. Secuencia 5´UTR del gen cnb de T. cruzi 058PUJ. Los números a la izquierda indican la posición de nucleótidos en la secuencia, en negrita se señala la secuencia del SL común a todos los transcritos de T. cruzi y T. rangeli

El modelo de la figura 52 ilustra la estructura parcial del transcrito según los resultados presentados:

Figura 52. Modelo de transcrito cnb de T. cruzi 058PUJ. Se señala la secuencia del Spliced leader en rojo (39 pb), la 5´UTR en verde y la región codificante en azul. Se muestra la posición y dirección de los iniciadores utilizados.

La secuencia 5´UTR de T. cruzi 058PUJ presenta una identidad del 87% la cepa CL de T. cruzi (Moreno et al. 2007); por otro lado, presenta una identidad del 57% con la UTR obtenida para T. rangeli Tre.