MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DEL FACTOR

Las muestras plasmáticas (EDTA) fueron descongeladas a 4ºC, y alicuotadas en volúmenes de 150 µL en “eppendorfs” de plástico estériles. Los plasmas fueron centrifugados previamente al ensayo en una microcentrífuga (modelo 5415 R Eppendorf) a 1.300 rpm durante 10 minutos a 4ºC, aislándose el sobrenadante. Antes del ensayo tanto las muestras como los reactivos estuvieron 30 minutos a temperatura ambiente.

Los niveles del factor de necrosis tumoral alfa fueron determinados mediante un inmunoensayo enzimático (ELISA) (Strakine human TNF-alpha ELISA, Strathmann Biotec, Germany) basado en la técnica “sándwich” o de doble anticuerpo (Fig. 2):

1) Incubación durante 1 hora, a temperatura ambiente y en agitación, de 100 µL de cada muestra de plasma, con un anticuerpo monoclonal específico anti-TNF-alfa que se encuentra anclado a la pared de los pocillos de la microplaca.

2) Lavado de los pocillos (5 veces) con 300 µL de tampón de lavado. 3) Incubación de 1 hora, a temperatura ambiente y en agitación, con el

anticuerpo secundario biotinilado.

4) Lavado de los pocillos (5 veces) con 300 µL de tampón de lavado. 5) Incubación de 30 minutos, a temperatura ambiente y en agitación, con

100 µL del conjugado de estreptavidina-peroxidasa, que se une al antígeno formando un “inmuno-complejo”.

- 68 -

6) Lavado de los pocillos (5 veces) con 300 µL de tampón de lavado, para eliminar el exceso de anticuerpo de detección no unido al “complejo”. 7) Incubación de 30 minutos, en oscuridad y a temperatura ambiente, con

100 µL de 3,3’,5,5’ tetra metilbendicidina (TMB), que al unirse a la peroxidasa del anticuerpo de detección da un producto coloreado. 8) Adición de 100 µL de “solución de parada” (H2SO4) a la reacción

colorimétrica entre la peroxidasa y el TMB, produciendo un cambio de color.

9) Cuantificación de la absorbancia en densidades ópticas (DO) a una longitud de onda de 450 nm (longitud de referencia de 620 nm), en un lector de microplacas de longitud de onda dual (Sunrise, TECAN, Austria) usando el software Magellan (versión 2.5, TECAN, Austria). Los resultados se obtienen mediante la interpolación de la densidad óptica obtenida para cada muestra en una curva lineal obtenida a partir de las distintas concentraciones de TNF-alfa sintético. El rango de concentración del ensayo es de 0 a 1000 pg/mL, con un límite de detección de 1,3 pg/mL. La precisión intraensayo media fue 7,4% y la interensayo 8,9%.

1.6. MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DEL RECEPTOR SOLUBLE TIPO 1 DEL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL ALFA (sTNF-R1, p55/p60, sCD120a, TNFRSF1A)

Las muestras plasmáticas (EDTA) fueron descongeladas a 4ºC, y alicuotadas en volúmenes de 150 µL en “eppendorfs” de plástico estériles. Los plasmas fueron centrifugados previamente al ensayo en una microcentrífuga (modelo 5415 R Eppendorf) a 1.300 rpm durante 10 minutos a 4ºC y se aisló el sobrenadante. Antes del ensayo tanto las muestras como los reactivos estuvieron 30 minutos a temperatura ambiente.

Los niveles del receptor soluble tipo 1 del factor de necrosis tumoral alfa (sTNF-R1) fueron determinados mediante un inmunoensayo enzimático (ELISA) (Hbt human sTNF-R1 ELISA test kit, Hycult Biotechnology, The Netherlands) basado en la técnica “sándwich” o de doble anticuerpo (Fig. 2):

- 69 -

1) Incubación durante 2 horas a temperatura ambiente y en agitación, de 100 µL de cada muestra de plasma y con un anticuerpo monoclonal específico anti-sTNF-R1 anclado a la pared de los pocillos de la microplaca.

2) Lavado de los pocillos (4 veces) con 200 µL de tampón de lavado. 3) Incubación de 1 hora, a temperatura ambiente y en agitación, con un

anticuerpo secundario biotinilado.

4) Lavado de los pocillos (4 veces) con 200 µL de tampón de lavado. 5) Incubación de 1 hora, a temperatura ambiente y en agitación, con 100

µL del conjugado de estreptavidina-peroxidasa, que se une al antígeno formando un “inmuno-complejo”.

6) Lavado de los pocillos (4 veces) con 200 µL de tampón de lavado, para eliminar el exceso de anticuerpo que no se une al “complejo”.

7) Incubación de 30 minutos, en oscuridad y a temperatura ambiente, con 100 µL de 3,3’,5,5’ tetra metilbendicidina (TMB), que se une a la peroxidasa del anticuerpo de detección dando un producto coloreado. 8) Adición de 100 µL de “solución de parada” a la reacción colorimétrica

entre la peroxidasa y el TMB, que produce un cambio de color.

9) Cuantificación de la absorbancia en densidades ópticas (DO) a una longitud de onda de 450 nm (longitud de referencia de 620 nm), en un lector de microplacas de longitud de onda dual (Sunrise, TECAN, Austria) usando el software Magellan (versión 2.5, TECAN, Austria). Los resultados se obtienen mediante la interpolación de la densidad óptica obtenida para cada muestra en una curva lineal construida a partir de las distintas concentraciones de sTNF-R1 sintético. El rango de concentración del ensayo es de 15,6 a 1000 pg/mL, con un límite de detección de 25 pg/mL. La precisión intraensayo media fue 6,5% y la interensayo 9,1%.

- 70 -

1.7. MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DEL RECEPTOR SOLUBLE TIPO 2 DEL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL ALFA (sTNF-R2, p75/p80, sCD120b, TNFRSF1B)

Las muestras plasmáticas (EDTA) fueron descongeladas a 4ºC, y alicuotadas en volúmenes de 150 µL en “eppendorfs” de plástico estériles. Los plasmas fueron centrifugados previamente al ensayo en una microcentrífuga (modelo 5415 R Eppendorf) a 1.300 rpm durante 10 minutos a 4ºC y se aisló el sobrenadante. Antes del ensayo tanto las muestras como los reactivos estuvieron 30 minutos a temperatura ambiente.

Los niveles del receptor soluble tipo 2 del factor de necrosis tumoral alfa (sTNF-R2) fueron determinados mediante un inmunoensayo enzimático (ELISA) (Hbt human sTNF-R2 ELISA test kit, Hycult Biotechnology, The Netherlands) que se basa en la técnica “sándwich” o de doble anticuerpo (Fig. 2):

1) Incubación durante 2 horas, a temperatura ambiente y en agitación, de 100 µL de cada muestra de plasma y con un anticuerpo monoclonal específico anti-sTNF-R2 que se encuentra anclado a la pared de los pocillos de la microplaca.

2) Lavado de los pocillos (4 veces) con 200 µL de tampón de lavado. 3) Incubación de 1 hora, a temperatura ambiente y en agitación, con el

anticuerpo secundario biotinilado.

4) Lavado de los pocillos (4 veces) con 200 µL de tampón de lavado. 5) Incubación de 1 hora, a temperatura ambiente y en agitación, con 100

µL del conjugado de estreptavidina-peroxidasa, que se une al antígeno formando un “inmuno-complejo”.

6) Lavado de los pocillos (4 veces) con 200 µL de tampón de lavado, para eliminar el exceso de anticuerpo que no se une al “complejo”.

7) Incubación de 30 minutos, en oscuridad y a temperatura ambiente, con 100 µL de 3,3’,5,5’ tetra metilbendicidina (TMB), que se une a la peroxidasa del anticuerpo de detección dando un producto coloreado.

- 71 -

8) Adición de 100 µL de “solución de parada” a la reacción colorimétrica entre la peroxidasa y el TMB, produciendo un cambio de color.

9) Cuantificación de la absorbancia en densidades ópticas (DO) a una longitud de onda de 450 nm (longitud de referencia de 620 nm), en un lector de microplacas de longitud de onda dual (Sunrise, TECAN, Austria) usando el software Magellan (versión 2.5, TECAN, Austria). Los resultados se obtienen mediante la interpolación de la densidad óptica obtenida para cada muestra en una curva lineal construida a partir de distintas concentraciones de sTNF-R2 sintético. El rango de concentración del ensayo es de 15,6 a 1000 pg/mL, con un límite de detección de 25 pg/mL. La precisión intraensayo media fue 4,7% y la interensayo 7,6%.

2 3 PARED POCILLO MICROPLACA 4 6 1 5 7

Figura 2. Principio del inmunoensayo enzimático: El anticuerpo monoclonal primario se encuentra anclado a la pared del pocillo de la microplaca (1). Éste se une a la molécula a determinar (2). Seguidamente se añade el anticuerpo secundario biotinilado que se unirá al complejo (3). A continuación se introduce en el pocillo un conjugado de estreptavidina-peroxidasa formándose un inmuno-complejo (4). Después se añade el TMB (3,3’,5,5’ tetra metilbendicidina (5) que se unirá a la peroxidasa para producir una reacción colorimétrica, que será bloqueada con la adición de una “solución de parada” (6), cuya enzima cataliza un cambio de color en cada pocillo de la microplaca (7).

- 72 -

1.8. MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE INTERLEUCINA-6