Método de difusión en disco

En este caso el aceite esencial, puro o diluido, se aplica en un disco de difusión, que se deposita en el centro de la placa Petri en contacto directo con el medio de cultivo o en la tapa de la placa en fase vapor. Este último caso se utiliza para comprobar y medir la actividad en fase vapor de los compuestos volátiles de la sustancia bajo estudio.

El moho suele sembrarse de dos maneras, bien por extensión, en cuyo caso suelen emplearse 100 µL de suspensión, o bien por el depósito de una gota de inóculo en el centro del medio de cultivo, dando lugar al llamado “diámetro o radio de la colonia” explicado anteriormente.

En el caso de la siembra por extensión, el moho suele crecer de la misma manera tanto en el ensayo de contacto directo como en el de fase vapor. Es decir, la zona central, situada alrededor de donde se encuentra depositado el disco activo, es donde el aceite esencial se encuentra en una mayor concentración. Debido a esto, generalmente en esta zona se crea una inhibición del crecimiento del moho denominada “halo, zona o área de inhibición” (H.I.). Generalmente el aceite esencial es absorbido por el agar, comenzando entonces un gradiente de concentración desde el centro (punto de mayor concentración) hasta la periferia de la placa Petri. Debido a ello, junto a la zona de inhibición suele encontrarse otra de menor crecimiento llamada “halo, zona o área de retardo” (H.R.) en la cual predomina un crecimiento micelar con falta de esporulación. En este punto es posible también encontrar daños en la formación del micelio en función de la proximidad a la zona de inhibición, debido a la mayor o menor influencia del activo (Manso S., et al. , 2013). Por último, la zona más externa de la placa (referida a lo largo de esta tesis como “zona 2”) presenta una menor exposición al aceite esencial, siendo por ello la zona con mayor tasa de esporulación en el caso de que el moho haya llegado a hacerlo. Las tres zonas explicadas pueden observarse en la figura 2.2.

Lógicamente, el tamaño de cada una de las áreas mencionadas estará influenciado por muchas variables, entre ellas: la solubilidad del aceite esencial en el agar, el tamaño del inóculo, la capacidad antifúngica del aceite esencial, la concentración inicial de éste, la velocidad de liberación del mismo y la concentración alcanzada en el agar, y finalmente, del tiempo de exposición al mismo.

Además hay que considerar que cuando el moho consigue vencer a la acción del aceite esencial, debido a lo explicado anteriormente, éste suele comenzar su desarrollo desde la parte más periférica de la placa hasta que al llegar al punto central, ve dificultado su crecimiento por encontrarse justo debajo del foco principal de exposición. Sin embargo, en estos casos donde se observa dicho inicio del crecimiento, suele observarse un comportamiento fungiestático, es decir, conforme avanza el tiempo de exposición (altamente dependiente de la concentración de inóculo y de aceite esencial) el área de inhibición termina finalmente por desaparecer. A pesar de esto, incluso en esos casos se mantiene siempre la existencia de zonas diferentes de crecimiento, indicadoras del mencionado gradiente de concentración de aceite esencial en el agar.

Fig. 2.2 Zonas de crecimiento producidas por el aceite esencial de canela en fase vapor

tras 10 días de incubación a 25 °C sobre el moho Aspergillus flavus en PDA. El disco no aparece ya que se retiró la tapa para hacer la fotografía.

Antes de continuar hay que recordar, como ya se ha comentado en la introducción de la sección I, que la coloración que presenta un moho se debe fundamentalmente a su esporulación, la cual va a depender en primer lugar del medio de cultivo en el cual esté creciendo el mismo. De esta manera, siempre que se hable de una diferencia de coloración se estará haciendo referencia al medio utilizado en ese experimento en cuestión.

Así mismo, también hay que considerar las diferencias notables en cuanto al aspecto de los halos de crecimiento en función de la cepa estudiada y del aceite esencial empleado. Un caso claro lo representa el crecimiento de una misma cepa de moho bajo la exposición de los aceites esenciales de canela y de orégano. Dichas diferencias se pueden apreciar entre la figura 2.2 y figura 2.3. En esta última, la exposición del moho Aspergillus flavus al aceite esencial de orégano crea un halo de retardo que consiste fundamentalmente en líneas de bajo crecimiento micelar o colonias de diámetro casi inapreciable (de pocos milímetros) alrededor del halo de inhibición. En el caso de haber más de un halo de retardo dentro de la misma placa, estos consistirán en zonas cuya única diferencia visible será la intensidad del crecimiento. Debido a esto, las áreas en este caso son más difíciles de marcar que en el caso de la canela, sobre todo en las fases iniciales de crecimiento ya que en ese momento el desarrollo que se crea en torno al halo de inhibición es tan sutil, que puede pasar inadvertido al ojo. Por tanto, conviene prestar mucha atención a la presencia de este mínimo crecimiento, teniendo siempre presente que el halo de inhibición seguirá siendo aquel bajo el cual no se aprecie crecimiento de ningún tipo.

Zona periférica (o Zona 2)

Halo de retardo I (o Zona 1) Halo de retardo II

Halo de inhibición

Fig. 2.3 Zonas de crecimiento producidas por el aceite esencial de orégano en contacto directo

tras 7 días de incubación a 25 °C sobre el moho Aspergillus flavus.

Por su parte, el aceite esencial de canela, presenta unas zonas claramente diferenciadas, no sólo en cuanto a la intensidad de crecimiento, sino también a la tasa de esporulación y a la coloración o la intensidad de la misma. Como se puede apreciar en la figura 2.2, la exposición a éste provoca en Aspergillus flavus la creación de dos halos de retardo diferentes. La limitación de las diferentes áreas, como vemos, es muy clara en contraste con el caso del orégano mencionado previamente (figura 2.3).

Pero, incluso empleando el mismo aceite esencial no todas las cepas presentan el mismo aspecto. Así, el género Penicillium suele presentar un halo de retardo finísimo, que consiste fundamentalmente en una reducción de la tasa de esporulación (figura 2.4.). En este caso, la gama de coloración entre las diferentes zonas no es tan amplia como por ejemplo, en el caso del comentado Aspergillus flavus.

Fig. 2.4 Zonas de crecimiento producidas por el aceite esencial de canela en contacto directo

tras 7 días de incubación a 25 °C sobre el Penicillium roqueforti.

1.1.3. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (MIC) y