Métodos de aislamiento

Según el método de aislamiento utilizado se pueden obtener dominios de membrana que varían en su composición lipídica, pero comparten propiedades físicas. Juntos forman el heterogéneo conjunto de los “lipid rafts” (Pike, 2004)

2.4.1. Métodos con detergentes: Son los métodos aplicados tradicionalmente para el aislamiento de estos microdominios (Pike, 2003; Pike, 2004). De manera general, se emplea Tritón X-100 frío al 1% para homogeneizar las células. Los “rafts” se aislan, por flotación, de las primeras fracciones de un gradiente continuo de densidad de sacarosa del 5 al 30% (Pike, 2003). Además de Tritón X-100 se ha empleado gran variedad de detergentes a distintas concentraciones y, de este modo, se han conseguido aislar dominios de membrana que varían en su composición lipídica (Schuck et al., 2003).

Existen problemas asociados al uso de detergentes para la extracción de “lipid rafts”, ya que es posible que algunos de estos compuestos extraigan selectivamente poblaciones de proteínas o lípidos, proporcionando “rafts” cuya composición no se corresponde con la de los dominios presentes en la membrana original.

2.4.2. Métodos sin detergentes: Teniendo en cuenta los incovenientes anteriores, se pretende un uso más generalizado de métodos sin detergentes para la obtención de los “lipid rafts” (Persaud-Sawin et al., 2008). Del mismo modo que en los métodos detergentes, el aislamiento de los “rafts” se consigue por flotación en un gradiente continuo de densidad de sacarosa del 5 al 30%, pero evitando el uso de tampones con compuestos detergentes

(Persaud-Sawin et al., 2008). Se basan en la fragmentación mecánica de las membranas como paso previo a su separación en gradiente de densidad. A tal efecto, se pueden aplicar métodos mecánicos, haciendo pasar el lisado varias veces a través de una aguja de un determinado grosor (Persaud-Sawin et al., 2008). Sin embargo, los métodos más conocidos y aplicados son los desarrollados por Song (Song et al., 1996) y Smart (Smart et al., 1995), que aplican la sonicación para fragmentar las membranas. El método de Smart se ha sugerido como el más adecuado para obtener unos “lipid rafts” altamente purificados, cuya composición es probablemente la más aproximada a la de los “rafts” presentes en células vivas (Pike, 2003; Pike, 2004).

2.5. Funciones

En un principio, la función atribuida a los lípidos de membrana fue la de servir como solventes para algunas proteínas (Singer and Nicolson, 1972). Sin embargo, las interacciones moleculares que ocurren en los “lipid rafts” son de gran relevancia para el buen funcionamiento celular.

Los “lipid rafts” se han implicado en multitud de procesos celulares. De este modo, se ha descrito su participación en el control de la adhesión y migración celular, en el establecimiento de las sinapsis, en la organización del citoesqueleto, y en la distribución y tráfico de proteínas en procesos de exo y endocitosis (Brown and London, 1998; Simons and Toomre, 2000). También intervienen en procesos patológicos, al ser las regiones de membrana por donde virus (Suomalainen, 2002), bacterias (Munro, 2003) y toxinas (Kovbasnjuk et al., 2001) atacan a las células. Además, son las zonas de membrana donde se localizan las placas de proteína amiloide en enfermedades priónicas (Naslavsky et al., 1997) y en la enfermedad de Alzheimer (Ehehalt et al., 2003)

Por otra parte, los “lipid rafts” funcionan como plataformas de señalización, donde se concentran gran parte de proteínas implicadas en dicho proceso. De hecho, estos microdominios propician una señalización rápida y eficaz al facilitar la interacción entre moléculas de una misma ruta de señalización (Incardona and Eaton, 2000; Simons and Ikonen, 1997). Esta eficacia se traduce en un aumento de la especificidad en la señalización, puesto que si la localización de un determinado receptor se restringe a una clase determinada de “lipid raft” se crea una compartimentalización de las rutas que impide respuestas inespecíficas (Simons and Ikonen, 1997). Parece que un “lipid raft" aislado contiene proteínas concretas, pero varios de estos microdominios pueden agruparse, facilitando interacciones entre moléculas que inician o amplifican la señalización (Janes et al., 1999). También se les ha atribuido un papel como moduladores de la actividad de determinadas proteínas; es el caso de algunos receptores tirosina quinasa, cuya actividad depende de su localización en “lipid rafts” (Pike, 2003).

3. Alteración del contenido de colesterol en membrana

La importancia fisiológica del colesterol en la membrana ha suscitado un gran interés durante los últimos años. Sus niveles se mantienen dentro de los valores que garantizan la integridad estructural de la membrana por el equilibrio establecido entre la captación de colesterol del exterior celular y la síntesis de novo. Muchas de las implicaciones de los “lipid rafts” en los procesos celulares se han descubierto alterando, de forma dirigida, estos niveles. Dichas variaciones conducen a cambios en su estructura y funciones. Especialmente importante es el hecho de que estas anomalías se hayan relacionado con el desarrollo de diversas patologías humanas, tales como cáncer, arterioesclerosis, enfermedad de Alzheimer e insulinorresistencia y diabetes (Schwencke et al., 2006). Los estudios sobre el efecto del

dianas terapeúticas (Zidovetzki and Levitan, 2007).

La mayoría de estudios dirigidos a la alteración en los niveles de colesterol en membrana se centran en la disminución del contenido de colesterol en “lipid rafts”. Este descenso se consigue mediante el uso de inhibidores de su síntesis aportados en un medio carente de colesterol o extrayendo el colesterol directamente de la membrana plasmática con el uso de ciclodextrinas (CDs) (Munro, 2003).

Las CDs son oligosacáridos cíclicos productos primarios de la degradación del almidón. A pesar de ser solubles en agua, contienen una cavidad capaz de albergar moléculas hidrofóbicas (Davis and Brewster, 2004). Las βCDs son las que presentan mayor afinidad por el colesterol y eficiencia en su extracción de las membranas (Ohtani et al., 1989). La metilación de estas moléculas aumenta significativamente su solubilidad en agua; así las metil-βCDs (βMCD) son las más utilizadas para disminuir el contenido de colesterol en la membrana plasmática (Zidovetzki and Levitan, 2007). Además de extraer colesterol, estas moléculas inducen cambios en las propiedades físicas de estos dominios (Zidovetzki and Levitan, 2007), provocan la desaparición de caveolas (Zidovetzki and Levitan, 2007) y deslocalizan varias proteínas de los “lipid rafts” (Kabouridis et al., 2000). Sin embargo, esto no significa que extraigan el colesterol exclusivamente de los “lipid rafts” y no de otras regiones de membrana. En este sentido, varios estudios apuntan a que las βMCDs extraen colesterol de ambas regiones, aunque lo hacen más eficazmente de los “lipid rafts” (Larbi et al., 2004).

A pesar de mostrar una mayor afinidad por el colesterol, las βMCDs también son capaces de extraer fosfolípidos de la membrana (Irie et al., 1992), y de interaccionar con los dominios hidrofóbicos de algunas proteínas como la insulina (Aachmann et al., 2003).

La manera en que las CDs reducen el contenido de colesterol de la membrana plasmática no reproduce ningún mecanismo fisiológico por el que la célula sea capaz de conseguirlo por sí misma, sino que se utiliza como mera herramienta experimental. Por ello, y porque puede tener efectos sobre otros compartimentos de la membrana celular que no son específicos de “lipid rafts” (Bickel, 2002), es más adecuado reducir los niveles de colesterol modulando las enzimas de su ruta de síntesis, por ejemplo, con el uso inhibidores específicos de estas enzimas (Fig 1A y B).

4. Efectos de la reducción del contenido de colesterol sobre la estructura,

propiedades y funcionalidad de los “lipid rafts”

Se conoce que la acumulación de distintos intermediarios de la colesterogénesis, como la que ocurre en las deficiencias congénitas de diversas enzimas de la ruta de síntesis de colesterol, conduce a su incorporación a los “lipid rafts” alterando la estabilidad y propiedades de estos dominios (Megha et al., 2006).

Gran parte de los intermediarios esteroles que se forman en la biosíntesis de colesterol se transportan a la membrana plasmática y de ahí vuelven al RE para transformarse finalmente en colesterol (Yamauchi et al., 2007). Sin embargo, su capacidad para formar “lipid rafts” permanece en estudio.