Métodos de análisis de la vitamina C

• Métodos de extracción de la vitamina C

Los solventes más utilizados para la extracción de la vitamina C son reactivos ácidos, que protegen por una parte a la vitamina C de su oxidación e hidrólisis, y a su vez precipitan proteínas. La mayoría de estos reactivos incluyen los ácidos metafosfórico, tricloroacético, oxálico o perclórico solos o en combinación con otros ácidos o con alcoholes de cadena corta, como el metanol y el etanol. Entre los ácidos citados, se ha documentado que el ácido metafosfórico es el más efectivo para productos vegetales en general. Sin embargo, para productos cítricos se ha observado que es más estable la mezcla ácido oxálico-acético (Russell, 2004).

A estos reactivos de extracción se les podría adicionar un compuesto reductor para proteger al AAS de su oxidación, y para reducir el ADA a AAS, permitiendo la cuantificación de la vitamina C total. De este modo, para poder determinar la vitamina C total, el ADA debe reducirse antes de la separación cromatográfica a AAS con L- cisteína, homocisteína, o ditiotreitol (DTT) o derivatizarse con o-fenildiamina para formar un compuesto detectable fluorométricamente (Dhariwal y col. 1990; Lykkesfeldt y col. 1995; Esteve y col. 1997; Kall y Andersen, 1999; Buss y col. 2001). Entre todos

los reductores, el DTT es el más utilizado. Recientemente, se ha demostrado que el hidrocloruro de Tris (2-carboxietil)-fosfina (TCEP · HCl) ofrece mayor eficiencia en la reducción del ADA a pH bajos comparado con el DTT y mejora la retención (y la separación) de los distintos isómeros del AAS en la columna cromatográfica. La conversión del ADA en AAS en presencia de agentes reductores también es útil para facilitar el análisis de los alimentos, ya que sin estos reductores la cuantificación del ADA resulta difícil debido a su inestabilidad (Fontannaz y col. 2006).

Igualmente, se podrían adicionar compuestos quelantes de metales como EDTA, desferrioxamina o ácido dietilentriaminopentacético para proteger la oxidación producida por metales como el hierro o el cobre.

Otras precauciones a tener en cuenta para evitar la oxidación del AAS serían mantener la muestra en un ambiente con gas inerte como nitrógeno, helio o argón, realizar la extracción a bajas temperaturas, almacenar las muestras rápidamente a -70ºC en el caso de no realizar la determinación analítica posteriormente a la extracción y limitar la exposición de las muestras a la luz (Russell, 2004).

• Determinación de la vitamina C

La cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) es el método analítico más utilizado para la determinación de las vitaminas hidrosolubles en alimentos (Wimalasiri

y Wills, 1983; Esteve y col. 1995; Kall y Andersen, 1999; Buss y col. 2001; Steffensen y col. 2002; Tudela y col. 2002; Sánchez-Moreno y col. 2003), sobretodo con columna en fase reversa y fase móvil formada por distintas proporciones de acetonitrilo y metanol en presencia de soluciones reguladoras de pH (ácido cítrico, ácido acético y fosfato) o soluciones acuosas de ácido cítrico.

La forma oxidada (ADA) y reducida (AAS) de la vitamina C han sido determinadas en diferentes muestras usando el detector UV a 210 o 254nm. Igualmente, se ha determinado el contenido de vitamina C total en zumos de naranja y otros alimentos, después de reducir el ADA a AAS, utilizando el detector UV. La absorción máxima del ADA, 210-227nm, lo hace particularmente susceptible a interferencias de diferentes compuestos presentes en los alimentos. Además, la absorción del ADA es baja, presentando una falta de sensibilidad analítica. A diferencia del ADA, el AAS absorbe fuertemente, y tiene su máximo de absorción entre 245-270nm, en función del pH de la muestra una vez se ha realizado su extracción.

La determinación del AAS con HPLC y detector electroquímico también ha sido utilizada en muestras de zumo de naranja, bebidas, vegetales, carne y plasma. A pesar de que el detector electroquímico presenta unos límites de detección bajos y una elevada selectividad, el ADA y el isoADA son electroquímicamente negativos.

El método de HPLC con detección por fluorescencia también ha sido utilizado para la determinación de la vitamina C en alimentos, para ello es necesaria una derivatización previa del ADA y del isoADA a un derivado fluorescente. En cambio, para el AAS y el isoAAS no se conocen derivados fluorescentes. Sin embargo, ellos pueden ser detectados electroquímicamente basándose en sus capacidades reductoras (Russell, 2004).

Resumiendo, el AAS y el isoAAS se detectan directamente con un detector UV o electroquímico y sus formas oxidadas se detectan fluorométricamente después de su derivatización (Ancos y col. 2000; Ostdal y col. 2000; Nielsen y col. 2001; Kall y Andersen, 1999).

Un método de derivatización seria la reacción del ADA con o-fenilendiamina para formar un producto de condensación tricíclico muy fluorescente. Otro procedimiento alternativo a la o-fenildiamina, implica la condensación del ADA con fenilhidracina para formar un derivado detectable espectrofotométricamente, el ascorbil-bis- fenilhidracina. Aunque los dos métodos de derivatización pueden interferir con los carbonilos de los alimentos, el método de la o-fenilendiamina es más específico y sensible que el de la fenilhidracina (Fennema, 2000).

Otros métodos utilizados para la detrminación de la vitamina C son los métodos espectofotométricos, siendo los más comunes los que utilizan cobre para oxidar el AAS y el ADA hasta ácido dicetogulónico. Estos productos reaccionan con la 2,4- dinitrofenilhidrazina, para formar la bishidrazona roja, la cual en ácido sulfúrico fuerte, se redistribuye en un producto con una banda de absorción a 520 nm. Para distinguir el AAS reducido del oxidado, se omite el cobre de la mezcla reactiva, lo que permite determinar específicamente el ADA, mientras que el AAS se calcula por diferencia (Bowman y Russell, 2003).

Otro método muy utilizado es la volumetría directa utilizando un indicador redox como el colorante 2,6-diclorofenolindofenol. Esta reacción se basa en la reducción del colorante 2,6-diclorofenolindofenol a su forma incolora por parte del AAS en presencia de un medio ácido. La AOAC International recomienda dos métodos volumétricos (967.21 y 985.33) basados en la reducción del 2,6-diclorofenolindofenol por el AAS, utilizado en zumos y preparados para lactantes. Sin embargo, a pesar de que es un método oficial, presenta dos limitaciones principales, una es la interferencia de otros agentes reductores presentes en los alimentos como el hierro y el cobre, y la otra limitación es la falta de respuesta del ADA, limitando su utilización en alimentos que contengan ADA. Además, extractos que tengan una elevada coloración pueden enmascarar el punto final de la volumetría. De este modo, la volumetría directa con 2,6- diclorofenolindofenol sólo se utiliza para valorar soluciones que no contengan o contengan en muy poca cantidad substancias que puedan interferir y/o ADA.

En los casos que no pueda utilizarse el 2,6-diclorofenolindofenol como valorante para el AAS, se recomienda la tetraclorobenzoquinona. La valoración se realiza en presencia de EDTA que actúa tanto como indicador que como agente enmascarante ya que se asocia con iones metálicos. El punto final se detecta por la aparición de un color amarillo. A pesar de que este método no presenta interferencias del ácido cítrico, ácido oxálico, ácido tartárico, glucosa y maltosa, mezclas de AAS con tioles como cisteína, ácido o-mercaptobenzoico, ácido mercaptosuccínico y ácido 3-mercaptopropiónico no pueden ser valoradas. Otros compuestos menos utilizados para la volumetría han sido el dihidroxiindol y soluciones de yodo/bromo (Arya y col. 2000; Russell, 2004).

El isoAAS puede adicionarse a los alimentos como antioxidante, hecho que puede sobrevalorar la cantidad de vitamina C total en los alimentos. Además, en los alimentos podemos encontrar trazas de los productos derivados de la oxidación del isoAAS, ácido dehidroisoascórbico (isoADA). En todos los casos, es importante volver a mencionar que el contenido de vitamina C total es la suma únicamente de AAS y ADA (Russell, 2004). Para conocer el contenido de vitamina C de alimentos que contienen isoAAS no puede utilizarse ni el método volumétrico, ni el de condensación con reactivos carbonilo (derivatización), ya que estos métodos también responden a este compuesto nutritivamente casi inactivo (isoAAS), es decir, no discriminan entre el AAS y el isoAAS (Fennema, 2000).

Es importante conocer también la existencia de métodos enzimáticos basados en la utilización de enzimas específicos para determinar los niveles de AAS mediante la formación final de un compuesto detectable espectofotométricamente (Besinger y col. 1978; Liu y col. 1982; Lee y col. 1997; Badrakhan y col. 2004). Sin embargo, estos métodos enzimáticos, no permiten determinar la vitamina C total, sino sólo el AAS, al no permitir la reducción del ADA a AAS, además son técnicas más largas y presentan una menor recuperación del ácido ascórbico (Badrakhan y col. 2004).

La mayoría de métodos validados para la determinación de la vitamina C se han realizado en muestras de zumo de diferentes frutas. Para la determinación de la vitamina C en la leche humana, se suele recurrir a modificaciones de los métodos validados que existen para preparados para lactantes. En la tabla 8 se muestran algunos métodos de HPLC utilizados para la determinación de vitamina C en leche y alimentos lácteos.

Tabla 8. Métodos de HPLC para la determinación de vitamina C en leche y productos lácteos.

Parámetros de HPLC

Analito Muestra Preparación y extracción de la muestra Columna Fase Móvil Sistema de detección Referencia AAS Preparado para _lactantes Añadir MPA al 1%. Centrifugar. Diluir _{con MPA al 1%.}

Superspher 100RP-18

5μm

Isocrático

Solución tampón de potasio 0.1M pH 3.5 1ml/min

UV/VIS

245nm Esteve y col, 1995

AAS, isoAAS Preparado para lactantes en polvo

Total AAS+isoAAS: disolver muestra en H2O. Dejar con DTT a temperatura ambiente, 30 minutos para reducir el ADA y el isoADA a

AAS e isoAAS

AAS+isoAAS: Mezclar una segunda aliquota de la muestra en H2O. En los dos casos añadir MPA seguido de ACN.

Centrifugar. Capcell Pak NH2 5μm (250 × 4.6 mm) Isocrático ACN +25mM de hidrógenortofosfato de potasio+ácido fosfórico (800:200:7,5) 1mL/min Electroquímico +700mV Margolis y Schapira, 1997

AAS, ADA Preparado para _lactantes Añadir MPA al 1% que contenga ácido _{oxálico al 0.5%; pH 2}

Jupiter C18 5μm (250×4.6 mm) Phenomenex

Isocrático Fosfato 66mM-solución tampón de fosfato pH 4.5 con cloruro de dodeciltrimetilamonio 2.3mM y EDTA 2.5mM 1mL/min AAS: UV/VIS 247nm ADA: derivatización y detección por fluorescencia, 350/439 (ex/em) Kall y Andresen, 1999 Vitamina C

total Leche humana

Reducción del ADA a AAS con DTT. Dejar en reposo 15min a temperatura ambiente.

Añadir ácido perclórico 0.54M

Brownlee-Spheri-5- ODS (220 ×4.6 mm) Solución reguladora de acetato sódico 80mM y solución de EDTA 0.54mM pH 4.8 0.9mL/min UV/VIS 245nm Buss y col, 2001 AAS, isoAAS Preparado para lactantes en

polvo Añadir TCE-P.HCl a la muestra.

LiChrospher RP-18 5 μm (250 × 4.6 mm) Decilamina: ACN:solución acetato sódico (0.25mM):H2O (1.6:80:100:800) pH 5.4 UV/VIS 265nm Fontannaz y col, 2006

Abreviaturas de la tabla:: AAS: ácido L-ascórbico; ACN: acetonitrilo; ADA: ácido dehidro-L-ascórbico; DTT: ditiotreitol; isoAAS: ácido L-isoascórbico; isoADA: ácido deshiroisoascórbico; MPA: ácido metafosfórico; TCA: ácido tricloroacético; TCE-P.HCl: hidrocloruro de tris (2-carboxietil)-fosfina

4.6. Bancos de leche humana