Métodos basados en aproximaciones moleculares

Se han utilizado diversos tipos de herramientas moleculares para el estudio de los hongos MA, casi todas basadas en la técnica de PCR (polymerase chain reaction). En este sentido, Bruns & Gardes (1993), establecieron los siguientes criterios de selección de la región ideal para realizar las amplificaciones de PCR: (i) estar presente en todos los hongos de interés, (ii) permitir una amplificación selectiva del ADN del hongo, cuando éste se encuentra junto con el de la planta, y, por último, (iii) ser lo suficientemente variable como para permitir diseñar sondas específicas para diferentes categorías taxonómicas. Los genes de ADN ribosómico (ADNr) cumplen estos criterios, por lo que han sido comúnmente utilizados en este tipo de estudios. Además, en el genoma, tanto de procariotas como de eucariotas, existen repetidas copias de genes ribosómicos, que están altamente conservados.

Figura 3. Estructura de los genes ribosómicos nucleares de eucariotas.

Dentro de estos genes, las regiones codificantes (18S, 5.8S y 28S) son las más conservadas, las regiones espaciadoras transcritas internas (ITS) muestran un cierto grado de variación, mientras que las regiones espaciadoras intergénicas (IGS) son las más variables (Figura 3) (Lanfranco et al., 1998). Las secuencias de la subunidad pequeña del gen ribosómico (18S ADNr) evolucionan muy lentamente, por lo que son comúnmente usadas para estudiar la distancia evolutiva entre organismos relacionados (White et al., 1990).

De acuerdo con lo que antecede, el primer paso para desarrollar estas herramientas moleculares orientadas al estudio de la diversidad de hongos MA en muestras naturales sería definir una región apropiada para el diseño de unos oligonucleótidos que permitan la amplificación selectiva de todas las secuencias de hongos MA presentes en las muestras analizadas. En este sentido, Simon et al. (1992a y b; 1993a y b), que fueron los primeros en aplicar técnicas de PCR al estudio de genes nucleares asociados a la subunidad 18S ADNr de los hongos MA, diseñaron el oligonucleótido “específico” de Glomales (actuales Glomeromicetos) VANS1 capaz de amplificar ADN fúngico en raíces. A partir de las primeras secuencias de hongos MA obtenidas con este oligonucleótido, se confirmó la clasificación por familias que se había elaborado previamente en base a estudios morfológicos. Posteriormente, fueron diseñados oligonucleótidos específicos para algunos géneros, VAGLO (Glomus), VAACAU (Acaulospora), VALETC (G. etunicatum) y VAGICA (Gigaspora y Scutellospora) que permitieron la secuenciación de hongos MA desconocidos hasta el momento, confirmando así el gran avance que estas técnicas suponían. Después de algunos años en los que se demostró que el oligonucleótido VANS1, a pesar del gran avance que supuso,

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presentaba muchos problemas para amplificar algunos géneros de hongos MA, Helgason et al. (1998) diseñaron el oligonucleótido AM1 que amplificaba ADN de hongos MA, excluyendo el ADN de las plantas hospedadoras. Este oligonucleótido en combinación con el NS31, universal para eucariotas, amplifica una región del gen 18S ADNr de la mayoría de familias de hongos MA, excluyendo Archaeosporaceae y Paraglomaceae. Paralelamente, Redecker (2000) diseñó oligonucleótidos específicos para cada una de las familias de hongos MA.

El análisis de las relaciones entre diferentes especies de hongos MA se ha realizado en otros estudios mediante el análisis de la región ITS (Lloyd-MacGilp et al., 1996; Redecker et al., 1997; Renker et al., 2005), utilizando oligonucleótidos universales como ITS1 e ITS4 (White et al., 1990). Esta región, menos conservada que la subunidad pequeña, no parece la más adecuada para el estudio de la diversidad de los hongos MA debido al alto grado de polimorfismo detectado en la composición nucleotídica entre esporas de hongos MA morfológicamente iguales e incluso dentro de una misma espora (Sanders, 1995). También, se han diseñado oligonucleótidos que amplifican específicamente una región de la subunidad ribosomal grande de distintos géneros de hongos MA (van Tuinen et al., 1998; Trouvelot et al., 1999; Gollote et al., 2004), que funcionan tan sólo adecuadamente en un determinado rango de plantas hospedadoras (Cesaro et al., 2008), ya que pueden amplificar el ADN de la raíz de algunas especies vegetales (Sánchez-Castro, en preparación).

En la literatura científica especializada se recogen continuamente publicaciones que describen los intentos de diseñar oligonucleótidos que amplifiquen todas las familias de hongos MA y que no presenten problema alguno de inespecificidad (Saito et al., 2004; Wubet et al., 2006). Hasta la fecha de inicio de esta Tesis Doctoral, no se habían conseguido unos oligonucleótidos que cumplieran totalmente con estos requisitos. No obstante, el oligonucleótido AM1 mencionado anteriormente es el que se ha utilizado mayoritariamente con éxito en la mayoría de estudios moleculares de diversidad de hongos MA en muy diversos tipos de ecosistemas (Helgason et al., 1998; Whitfield et al., 2004; Öpik et al., 2008a; Sonjak et al., 2009). Por último, mencionar que recientemente y, gracias a la existencia de un mayor número de secuencias de hongos

MA, se están diseñado nuevos oligonucleótidos que presentan mayor especificidad que el AM1 y que además amplifican todas las familias conocidas de hongos MA (Lee et al., 2008, Krüger et al., 2009).

Una vez amplificado específicamente el ADN de los hongos MA, se han aplicado numerosas técnicas moleculares, ya utilizadas previamente en estudios de diversidad de otros microorganismos. Entre estas técnicas se encuentran el RFLP (Restriction fragment length polymorphism, análisis de polimorfismos en fragmentos de restricción) (Helgason et al., 2002), SEAD (Selective enrichment of amplified DNA, enriquecimiento selectivo de ADN amplificado) (Clapp et al., 1995, Redecker et al., 2003) o la construcción y análisis de genotecas (Helgason et al., 1998 y 1999; Ferrol et al., 2004; Santos-González et al., 2007; Hempel et al., 2007; Öpik et al., 2008a).

La irrupción en los últimos años de técnicas de electroforesis en geles de poliacrilamida, como la electroforesis con gradiente de temperatura (temperature gradient gel electrophoresis, TGGE; temporal temperature gradient gel electrophoresis, TTGE) (Cornejo et al., 2004, Sonjak et al., 2009), la electroforesis con gradientes desnaturalizantes (denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) (Santos-González et al., 2006), polimorfismo del fragmento terminal de restricción (Terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP) (Pietikainen et al., 2007) o la técnica electroforética de polimorfismo de conformación de cadena simple (single strand conformational polymorphism, SSCP) (Stukenbrock & Rosendahl, 2005), ha supuesto un nuevo impulso en los estudios de diversidad microbiana y en la monitorización de las dinámicas poblacionales (Muyzer & Smalla, 1998; Muyzer, 1999). Estas herramientas permiten la caracterización de poblaciones en un gel de poliacrilamida, por la huella genética que generan debido a las variaciones en las secuencias contenidas en productos de PCR de ADN ribosómico. Estas variaciones producen cambios en las condiciones de desnaturalización del ADN, con lo cual la movilidad de los diferentes fragmentos de ADN contenidos varía en el gel a medida que cambian las condiciones electroforéticas, produciéndose así la detención de la migración en distintos puntos del gel, de acuerdo a la composición nucleotídica de los fragmentos analizados.

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