MÉTODOS DE CABLEADO

Amersham Buchler GmbH, Braunschweig: Methionin-Labeling Mix, Thymidin. Beckman, M¨unchen:

Spektrophotometer DU 50. Biochrome KG, Berlin:

F¨otales K¨alberserum (FCS); RPMI 1640; DMEM. Biomol Feinchemikalien GmbH, Hamburg: 3-(N-Mor-pholino)propansulfons¨aure (MOPS). Biorad Lab., Richmond, Kalifornien, USA:

Bio-Rad Proteinassay; Mini-Protean II Elektrophorese-Kammer; PrepCellR-Elektrophorese- System, Helios-Gene-Gun, Tubing-Prepstation.

Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim:

Adenosin-5’-triphosphat (ATP); Chloramphenicoi; Streptomycin; Tris-(Hydroxyrnethyl)-amino- methan (Tris).

2 Materialien 19

Qiagen GmbH, D¨usseldorf:

Qiagen Plasmid Kits; Gel-Extraktionskit. Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA: Trypton; Hefeextrakt; Agar.

Eppendorf Ger¨atebau, Hamburg: Reaktionsgef¨aße 0,5,1,5 und 2,0 ml.. Fluka Feinchemikalien, Neu-Ulm:

Formaldehyd, Formamid; NonidetR-P40 (NP40). Greiner GmbH, N¨urtingen:

Plastik-Reagenzr¨ohrchen 10 und 50 ml; Monolayer-Flaschen f¨ur Zellkultur; Plastik- Petri- schalen (92 mm und 140 mm); Impfnadeln und Impf¨osen.

Immunotech, Hamburg: Antik¨orper.

Invitrogen, DeSchelp, NV Leek, Niederlande: pTracerCMV; Zeocin; TOPO blunt Kloning Kit.

Eastman Kodak Company, Rochester, New York, USA: R¨ontgenfilme XAR5, BioMax Filme.

Metabion, Martinsried: synthetische Oligonukleotide. E. Merck AG, Darmstadt:

Aceton; Ammoniumsulfat; Ammoniumperoxodisulfat (APS); Bors¨aure; Bromphenolblau (BPB); Calciumchlorid; Chloroform; Coomassie Brillant Blau R250; Dimethylsulfoxid (DMSO); Di- natriumhydrogenphosphat; Dikaliunihydrogenphosphat; Essigs¨aure; Ethanol; Ethidiumbromid; Ethylendiamintetraessigs¨aure (EDTA); Formaldehyd; Formanid; Glukose-Monohydrat; Iso- amylalkohol; Isopropanol; Kaliumacetat; Kaliumchlorid; Kaliumdihydrogenphosphat; Kali- umhydroxid; Lithiumchlorid, Magnesiumacetat, Magnesiumchlorid; Magnesiumsulfat; Man- ganchlorid; Methanol; 2-Mercaptoethanol; Natriumacetat; Natriumazid; Natriumchlorid; Na- triumcitrat; Natriumdihydrogenphosphat; Natriumdodecylsulfat (SDS); Natriumpyrophosphat; Polyethylenglycol 6000 (PEG); Salzs¨aure; D-Sorbitol; N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylendian¨un (TEMED); Triton X-100; Tween 20; Xylencyanol.

20 2 Materialien

Molecular Devices:

ELISA-Reader: Spectra MAX 250. Nunc-GmbH, Wiesbaden:

Cryo-Tubes 2 ml; Zellkulturflaschen; Zellkulturschalen. Perkin Elmer, Norwalk, USA:

PCR Thermal Cycler 480. Pharmacia, Freiburg:

2’-Desoxyribonukleosid-5’-triphosphate (dATP, dCTP, dCTP, dTTP); Protein G Sepharose. Pierce, Reckford, Illinois, USA:

SuperSignal Western Blotting Substrate. R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA: Antik¨orper, murines IL12, murines flt3 ligand. C. Roth, Karlsruhe:

Dithiothreitol (DTT); Glycerin; N-2-Hydroxyethylpiperazin-N’-2-ethansulfons¨aure (HEPES); Phenol/TE ges¨attigt.

Satorius Werke GmbH, G¨ottingen:

Mikrowaage 3705; Minisart NML Sterilfilter (0,2 und 0,45 gm Porengr¨oße).. Serva, Heidelberg:

Acrylamid.

Sigma Chemie, M¨unchen: Protease-Inhibitor-Mix. Schleicher und Sch¨ull, Dassel:

Nitrocellulosefilter BA85, Porengr¨oße 0,45µm. TOPLAB, Martinsried:

DNA-Sequenzierungen. Wallac, Turku, Finnland:

2 Materialien 21

Whatman Limited, Springfield Mill, Maidstone. Kentucky, USA: 3 MM-Papier.

Stragene:

Eagle-Eye Geldokumentationssystem. Vectorlabs:

3 Methoden

3.1 Klonierung und Vermehrung von DNA in E. coli

3.1.1 Bakterienhaltung

Die superhelikale Plasmid-DNA f¨ur Klonierungen und Tierversuche wurde in transforma- tionskompetenten Bakterien der E. coli St¨amme TOP10, DH5αund SSC 110 vermehrt. Soweit nicht gesondert vermerkt wurden alle mikrobiologischen Arbeiten nach Standardprotokollen durchgef¨uhrt [147].

Zum Vereinzeln von Bakterienkolonien wurden die Bakterien mit einer ausgegl¨uhten Impf- ¨ose auf Agarplatten ausgestrichen und bei 37 ◦_{C invertiert bebr¨utet. Transformationsans¨atze}

wurden mit sterilen Glaskugeln ausplattiert. Der LB-Agar wurde nach dem Autoklavieren unter R¨uhren auf 50◦_{C abgek¨uhlt und je nach Bedarf zur Selektion mit Ampicillin (50 mg/l)}

oder Kanamycin (50 mg/l) versetzt. Die Platten wurden bei 4◦_{C gelagert.}

F¨ur Fl¨ussigkulturen wurde LB-Medium nach dem Autoklavieren mit dem entsprechenden Antibiotikum versetzt und im Sch¨uttler bei 37◦_{C und ca. 200 U/min f¨ur 12-18 h bebr¨utet. Die}

Bakteriendichte wurde photometrisch bei 600 nm bestimmt (1 OD600=8∗108 Zellen/ml).

Zur dauerhaften Lagerung wurden 0.5 ml ¨Ubernachtkultur mit 0.5 ml LB-Glycerin (1:1 Gemisch aus LB-Medium und Glycerin) bei -80◦_{C eingefroren.}

LB-Medium: Trypton 10 g/l Hefeextrakt 5 g/l NaCl 5 g/l LB-Agar: Trypton 10 g/l Hefeextrakt 5 g/l NaCl 5 g/l Agar 15 g/l Ampicillin-Stamml¨osung: 50 mg/ml in H2O (sterilfiltriert) Kanamycin-Stamml¨osung: 50 mg/ml in H2O (sterilfiltriert) 22

3 Methoden 23

3.1.2 Herstellung transformationskompetenter Bakterien

Der verwendete Bakterienstamm (TOP10, DH5α und SSC110) wurde aus einer Dauerkultur zun¨achst auf einer LB-Platte ausgestrichen und ¨uber Nacht bei 37◦_{C bebr¨utet. Ein Einzelklon}

wurde dann in 50 ml TYM Medium (bei TOP10 mit 50µg/ml Streptomycin) ¨uberimpft, und ¨uber Nacht bei 37◦_{C und 180 rpm bebr¨utet. Diese Vorkultur wurde 1:100 bis 1:500 in TYM}

Medium (500 ml) ohne Antibiotikum ¨uberimpft und im Sch¨uttler bebr¨utet. Bei einer OD600

von 0.7 bis 0.8 wurde die Kultur rasch auf Eis abgek¨uhlt.

Alle folgenden Schritte wurden z¨ugig im Eiswasserbad erledigt, Zentrifuge und Puffer wa- ren vorgek¨uhlt: In 250 ml Corning-Zentrifugenbecher wurden die Bakterien f¨ur 10 min bei 3000 rpm zentrifugiert, der ¨Uberstand verworfen und das Zellpellet in 30 ml TfbI Puffer pro 100 ml Bakterienkultur resuspendiert, und erneut 10 min bei 2000 rpm zentrifugiert. Das Zell- pellet wurde in 4 ml TfbII pro 100ml Kultur aufgenommen und in gebrauchsfertigen Aliquots (50-400µl) in Eppendorf-Gef¨aßen bei -80◦_{C eingefroren.}

Die Transformationseffizienz wurde mit pUC18 Plasmid-DNA zu 0.7 bis 2.0*108

Kolonien proµg DNA bestimmt (f¨ur ein 100µl Aliquot).

TYM Medium: Bacto Trypton 2.0 % Bacto Yeast Extract 0.5 %

NaCl 0.1 M

MgCl2 10 mM

TfbI Puffer: KOAc 30 mM

CaCl2 100 mM

Glycerin 15 %

sterilfiltiert nach dem autoklavieren zugeben:

MnCl2 50 mM

TfbII Puffer: NaMOPS (pH=7.0) 10 mM

CaCl2 75 mM

KCl 10 mM

Glycerin 15 %

3.1.3 Transformation von Plasmid-DNA in kompetente E.coli

Plasmid-DNA oder Ligationsansatz wurden in 1.5 ml Gef¨aßen vorgelegt und f¨ur 30 min mit 50 µl frisch aufgetauten, kompetenten Bakterien auf Eis inkubiert. Dann erfolgte f¨ur 60 s ein Hitzeschock bei 42◦_{C, gefolgt von 2 min auf Eis. Dieser Ansatz wurde dann mit 500 µl}

24 3 Methoden

Platten (mit Selektionsantibiotikum) ausplattiert und ¨uber Nacht bebr¨utet.