Métodos de evaluación de los antisépticos

Al igual que en el caso de los desinfectantes, para cada antiséptico se debe comprobar su eficacia, primero mediante estudios in vitro y después con estudios prácticos. En una primera fase de los estudios in vitro se debe comprobar si los productos poseen o no actividad bactericida (frente a bacterias gramnegativas y grampositivas) y fungicida básica.

En la CEE, los antisépticos en la fase 1 de evaluación deben demostrar actividad frente a

S.aureus, P.aeruginosa y hongos, en ensayos de suspensión cuantitativos (UNE-EN 1040 y EN 1275) 20, 22, pruebas comunes para todos los productos biocidas. No obstante, este tipo de pruebas no son imprescindibles, por lo que muchos fabricantes evalúan los productos directamente para una aplicación específica. En una segunda fase se deben realizar ensayos específicos para la aplicación concreta del producto, en este caso la desinfección higiénica y quirúrgica de manos. Estos ensayos son pruebas de suspensión cuantitativa ampliada (fase 2/ etapa 1) en los que se incluyen microorganismos adicionales como E.coli k12 y

Enterococcus hirae y el efecto de sustancias interferentes en la actividad antimicrobiana (PrEN 12054) 60. Éste último aspecto es importante para los antisépticos que están en contacto con sangre y mucina, como es el caso de los antisépticos de uso oral o que se aplican sobre otras mucosas 61. En esta fase de ensayos actualmente se incluye la actividad virucida (PrEN 14476) 62, utilizando poliovirus tipo 1 y adenovirus tipo 5; en el futuro también se desarrollaran ensayos de evaluación de la actividad micobactericida frente a

M.terrae y M.avium; y de actividad fungicida frente a levaduras como Candida albicans. En EEUU, además se incorporan estudios con portagérmenes, incluidos los de actividad virucida, y el empleo de microorganismos patógenos asociados a infecciones nosocomiales

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. Sin embargo, este tipo de estudios in vitro no proporcionan información sobre la actividad de los antisépticos en la piel, mientras que los estudios in vivo sí (fase 2/ etapa 2). En la tabla 9 se detallan las normativas EN in vitro e in vivo, anteriormente comentadas, para los antisépticos utilizados en la desinfección de manos.

Tabla 9: Normativas EN de actividad biocida para antisépticos de manos. Normas, proyectos y normativas en elaboración

Tipo de actividad Tipo de utilización Fase/

Etapa _{Bactericida Fungicida Micobactericida Virucida}

Lavado higiénico de manos 2/1

2/2 PrEN 12054 EN 1499 63 WI 216039 - - - PrEN 14476 -

Tratamiento higiénico de manos por frotación (también denominada desinfección higiénica de manos)

2/1 2/2 PrEN 12054 EN 1500 64 WI 216039 - WI 16038 - PrEN 14476 -

Lavado quirúrgico de manos 2/1 2/2 PrEN 12054 PrEN 12791 65 WI 216039 - - - - -

Tratamiento quirúrgico de manos por frotación (también denominada desinfección quirúrgica de manos)

2/1 2/2 PrEN 12054 PrEN 12791 WI 216039 - - - - -

WI: normativas en elaboración; Pr: proyectos

1.8.3.2. Estudios in vivo

Los métodos in vivo son pruebas de laboratorio que simulan las condiciones reales del lavado de manos y que requieren la colaboración de voluntarios (fase 2/ etapa 2). Para ello, en los estudios para eliminar la flora transitoria se contaminan las manos de forma artificial y se usan como modelo para representar una situación en la que se requiere un tratamiento antiséptico para conseguir eliminar el mayor número de microorganismos posible. Este proceso se puede realizar para comprobar la eficacia de productos que se utilizan restregándose las manos, sin la utilización de agua o bien para antisépticos que si la requieran. Por el contrario, los productos evaluados para la desinfección quirúrgica de manos se ensayan por su habilidad para eliminar la flora residente, sin contaminar de forma artificial las manos de los voluntarios. Además, la eficacia de los antisépticos sobre la flora residente de la piel de las manos se puede evaluar en base a su efecto sobre los microorganismos: inmediato, persistente y residual.

La eficacia final del uso de un antiséptico para una indicación específica requiere una fase de estudios clínicos (fase 3), para los que todavía no existen normativas. Sin embargo, aún hoy en día, algunos estudios clínicos como por ejemplo la conveniencia de la desinfección quirúrgica de manos para prevenir las infecciones nosocomiales no ha sido demostrada aún,

por limitaciones de tipo ético y de tamaño muestral. Por otro lado, el tratamiento antiséptico de las mucosas y heridas presenta idénticos problemas. La mayoría de antisépticos utilizados hoy en día de forma preventiva o terapéutica sobre mucosas se seleccionan basándose únicamente en los datos obtenidos en los estudios in vitro. Por ello, recientemente Pitten et al. 66, 67 han sugerido el diseño de ensayos en fase 2/ etapa 2 para antisépticos orales.

Tanto en los estudios con flora transitoria como residente se precisa conocer el número de microorganismos presentes en las manos, previamente a la aplicación del antiséptico. Las bacterias no pueden contarse directamente sobre la piel, por eso la evaluación de la eficacia de un antiséptico debe basarse en el número de bacterias que se pueden recuperar a partir de un procedimiento estandarizado. Los resultados se pueden comparar con formulaciones de referencia, como jabón en el caso de los productos utilizados para el lavado higiénico de la piel; y alcohol isopropílico al 60% en el caso de productos con base alcohólica y tratamiento higiénico de las manos por frotación, si se realizan los ensayos en el mismo tiempo. El recuento de ufc se determina antes y después de haber utilizado el antiséptico, para establecer la tasa de reducción de microorganismos debida a éste (expresado en porcentaje o log10). Una reducción de 2.5-3 log10 se aplica para la desinfección higiénica de manos y de

3-5 log10 para la reducción de la flora residente.

Los principales métodos de recuperación de microorganismos supervivientes en los estudios

in vivo son la impresión y el lavado. La impresión puede realizarse de forma directa, al poner en contacto la zona de la piel sobre un medio de cultivo sólido; o por impresión indirecta, al tocar las yemas de los dedos una placa de Petri vacía y luego depositar medio sólido fundido. El lavado permite dispersar la flora presente en un medio líquido y posteriormente realizar un cultivo de éste. Variaciones de este método son el ensayo de Gaschen (la mano se introduce en una bolsa cerrada que contiene medio líquido de cultivo y posteriormente, se analiza el líquido y se realiza el recuento de microorganismos) y el ensayo de Walter del lavado del guante (la mano se introduce en un guante de tipo quirúrgico y se mantiene durante cierto tiempo, después del cual se lava el interior del guante con agua estéril y se analiza ésta).

Teniendo en cuenta lo expuesto anteriormente sobre la composición de la flora microbiana de la piel y las características de estos ensayos, en Europa el CEN TC 216 decidió establecer varias pruebas in vivo para la evaluación de los desinfectantes de manos en las siguientes aplicaciones: lavado higiénico de manos, tratamiento higiénico de manos por frotación, lavado quirúrgico de manos y tratamiento quirúrgico de manos por frotación (tabla 9). La normativa UNE-EN 1499 se aplica en el caso de productos para el lavado higiénico de manos, la UNE-EN 1500 para el tratamiento higiénico de las manos por frotación y la PrEN 12791 para antisépticos empleados en el lavado y tratamiento quirúrgico de manos 63-65. El microorganismo que se utiliza en este tipo de ensayos es E.coli k12, cepa de origen humano no patógena y que forma parte de la flora habitual de la piel.

En EEUU, los requerimientos de los ensayos in vitro e in vivo para los antisépticos de manos los establece la TFM de la FDA. En los ensayos in vivo de lavado de manos higiénico y quirúrgico se utiliza S.marcescens en lugar de E.coli k12. Sin embargo, ni en la CEE ni en EEUU existen evaluaciones in vivo con microorganismos nosocomiales u otros patógenos por razones éticas. Por ello, recientemente Messager et al. 68 han desarrollado un método ex-vivo con el objetivo de reducir las discrepancias de los resultados obtenidos entre diferentes estudios realizados con voluntarios y la inclusión de microorganismos patógenos.

En general, los estudios in vivo han demostrado, tanto para el lavado higiénico de manos como para el quirúrgico, que las formulaciones de antisépticos que contienen 60-95% de alcohol o alcohol combinado con QACs, hexaclorofeno o glucanato de clorhexidina son más efectivas que otros compuestos de acción más persistente. Los compuestos más activos, son por orden decreciente de actividad: glucanato de clorhexidina, yodóforos, triclosan y jabón neutro 59.

1.9. Factores físico-químicos que influyen en la evaluación de la actividad biocida de los antisépticos y desinfectantes

Cada tipo de antiséptico o desinfectante químico tiene una acción biocida característica, la cual se determina por su espectro antimicrobiano y su mecanismo de acción. Sin embargo, esta eficacia puede estar influenciada por diversos factores, frecuentemente adversos, cuando se utiliza el biocida (figura 8).

En los estudios in vitro existen una serie de factores que deben estandarizarse para que sea cual sea el método elegido, los resultados sean estrictamente dependientes del producto evaluado y del procedimiento de ensayo. A continuación pasamos a describir algunos de estos factores y su influencia sobre la actividad del biocida.

Figura 8: Factores que influyen en las interacciones entre biocida y microorganismo

BIOCIDA MICROORGANISMO DESTRUCCIÓN

(INACTIVACIÓN, VIRUS) Ó SUPERVIVENCIA Composición química Concentración Modo de acción Método de exposición al biocida Tiempo Temperatura pH Sustancias interferentes

Concentración de microorganismos en la mezcla de reacción Grado de agregación o de formación de clumps

Tamaño del microorganismo pH

Afinidad por lípidos

Sensibilidad de los métodos de detección

1.9.1. Factores pre-tratamiento