Métodos de tipado molecular.

Cada vez es más frecuente la utilización de métodos de tipado molecular para caracterizar los aislados bacterianos debido, principalmente, a que presentan un mayor poder discriminatorio que las técnicas de tipificación basadas en características fenotípicas, que suelen presentar, además, problemas de reproducibilidad (Heddleston, 1976; Hunt et al., 2000; Blackall y Miflin, 2000). A esto se ha de añadir que actualmente existen mejores medios técnicos en los laboratorios, se cuenta con sistemas informatizados, se han disminuido considerablemente los costes y se dispone de personal especializado.

Cada uno de los métodos de tipado molecular posee un diferente grado de tipabilidad, reproducibilidad, poder discriminatorio y facilidad de utilización,

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factores que hay que tener en cuenta en los estudios epidemiológicos (Arbeit, 1995).

Para caracterizar P. multocida se han utilizado diferentes técnicas. Entre las más utilizadas están:

-Análisis de restricción de plásmidos. Utilizado en cepas aisladas de ganado porcino (Gardner et al., 1994; Fussing et al., 1999) y aves (Diallo et al., 1995). Técnica basada en la purificación y separación de plásmidos mediante electroforesis en gel de agarosa. Es sencillo y económico pero tiene una aplicación limitada en estudios epidemiológicos, ya que no todos los aislados de P. multocida poseen plásmidos y, además, algunos los pueden perder en los sucesivos pases de cultivo (Fussing et al., 1999).

-AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). Este método está basado en la amplificación selectiva de fragmentos de ADN generados mediante digestión con enzimas de restricción. Se ha utilizado para subtipificar cepas de P. multocida relacionadas epidemiológicamente (Amonsin et al., 2002; Shivachandra et al., 2006), aunque no se ha determinado su reproducibilidad entre laboratorios.

-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). Esta es una técnica altamente reproducible en la que se generan bandas de restricción de ADN, dependiendo de la localización dentro del genoma de dianas de reconocimiento para endonucleasas de restricción específicas (Diallo et al., 1995). Utilizada principalmente en estudios epidemiológicos en casos de cólera aviar (Kim y Nagaraja, 1990; Carpenter et al., 1991).

-MLST (Multi-locus Sequence Typing). Con este método se detectan las variaciones de las secuencias aminoacídicas de diferentes enzimas mediante la secuenciación de ADN en genes seleccionados (generalmente housekeeping) (Spratt, 1999). Es un método altamente reproducible y de alto poder discriminatorio (Spratt, 1999).

-FAGE (Field Alternation Gel Electrophoresis). En este procedimiento se separan fragmentos grandes de ADN (de hasta 10 megabases) y se someten a electroforesis en gel. Discrimina entre diferentes serotipos, habiéndose utilizado en pocos estudios (Townsend y Dawkins, 1993).

-RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA). Mediante esta técnica se reconocen y amplifican secuencias al azar dentro del ADN genómico,

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obteniéndose patrones de bandas característicos. Esta técnica posee una baja reproducibilidad y falta de estandarización (Blackall y Miflin, 2000).

-Fingerprinting. También basada en la digestión del ADN mediante enzimas de restricción en la que se generan fragmentos que, posteriormente, se someten en un gel al paso de una corriente eléctrica. Ha demostrado su utilidad para discriminar entre aislados de aves de serotipos iguales (Carpenter et al., 1991; Wilson et al., 1993).

-REA (Restriction Enzyme Analysis). En ella se comparan el número y el tamaño de los fragmentos producidos por la digestión de ADN cromosómico mediante endonucleasas de restricción. Es una técnica que se ha utilizado con bastante frecuencia en estudios epidemiológicos, principalmente en casos de rinitis atrófica progresiva (RAP) (Harel et al., 1990; Gardner et al., 1994; Djordjevic et al., 1998) y otros procesos producidos por P. multocida (Olson y Wilson, 2001; Pedersen et al., 2003; Samuel et al., 2003). Presenta una buena reproducibilidad (Snipes et al., 1989), a pesar de que a veces produce patrones de bandas complicados y es necesario un software para su interpretación definitiva (Wilson et al., 1993; Goering, 1993; Kristjansson et al., 1994; Pedersen et al., 2003). El poder de discriminación de esta técnica depende de la enzima utilizada (Wilson et al., 1993; Rimler, 2000).

-Ribotipado. Los fragmentos de ADN obtenidos por REA son transferidos a una membrana e hibridados con una sonda de ADN, correspondiente a la molécula de gen del ARNr 16S o del ARNr 23S (Grimont y Grimont, 1986). Técnica muy utilizada para tipar P. multocida (Zhao et al., 1992; Gardner et al., 1994; Djordjevic et al., 1998; Fussing et al., 1999; Bowles et al., 2000; Muhairwa et al., 2001a; Muhairwa et al., 2001b; Rubies et al., 2002), pero, según algunos autores, de escaso poder discriminatorio (Dziva et al., 2004) y poco valor en estudios epidemiológicos (Saxena et al., 2005).

-REP-PCR (Repetitive Extragenic Palindromic PCR). Esta técnica está basada en la amplificación de elementos palindrómicos extragénicos repetitivos dentro del genoma bacteriano. Posee mejor poder discriminatorio que ERIC-PCR, ribotipado, RAPD-PCR y REA utilizando la enzima HindII (Townsend et al., 1997b; Townsend et al., 1998a; Gunawardana et al., 2000; Chen et al., 2002). -ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR). Mediante este procedimiento se obtiene un patrón de bandas, tras amplificar secuencias

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repetitivas intergénicas de consenso. Se ha utilizado en ocasiones, aunque no muestra un adecuado poder de discriminación (Loubinoux et al., 1999; Biswas et al., 2004).

-SE-AFLP (Single-enzyme Amplified Fragment Length Polymorphism). Se basa en la amplificación selectiva de un subgrupo de fragmentos de ADN generados por digestión con enzimas de restricción. Ha sido utilizada en ocasiones para tipificar P. multocida (Amonsin et al., 2002; Moreno et al., 2003). A pesar de ser una técnica laboriosa y complicada (Shivachandra et al., 2007) tiene mejor resolución que RAPD (Huber et al., 2002) y mayor poder discriminatorio que REA (Shivachandra et al., 2006).

-PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis). Técnica que se basa en la comparación de patrones de bandas generadas después de la digestión enzimática de todo el genoma bacteriano tras someterlo a una electroforesis multidireccional. De todas las técnicas moleculares PFGE es, hoy por hoy, la técnica considerada como el gold standard para el estudio molecular de P. multocida (Goering, 1993). Es una técnica que presenta una elevada reproducibilidad (Arbeit, 1995), además de demostrar un gran poder discriminatorio en la caracterización de P. multocida (Townsend et al., 1997a; Pedersen et al., 2003), diferenciando claramente aislados que son indistinguibles mediante serotipado o perfil de proteínas, por ejemplo (Johnson et al., 1991; Townsend et al., 1997a; Hunt et al., 2000). Posee mayor poder discriminatorio que el ribotipado (Kristjansson et al., 1994; Townsend et al., 1997a; Christensen et al., 1998; Gunawardana et al., 2000; Christensen et al., 2003) y la técnica de REP-PCR (Gunawardana et al., 2000) para caracterizar aislados de P. multocida. También se ha demostrado que la técnica de PFGE, utilizando la enzima ApaI, presenta mayor poder discriminatorio que ERIC-PCR (Leotta et al., 2006a), RAPD (Lainson et al., 2002; Shin et al., 2007) y que REA (Christensen et al., 1998; Gunawardana et al., 2000). Las principales desventajas que presenta esta técnica son el tiempo empleado, su laboriosidad, y que se requiere un equipo especial, lo que supone una elevada inversión.