MARCO METODOLÓGICO Y PLANTEAMIENTO DE LA PROPUESTA
2.2. Descripción del procedimiento metodológico para el desarrollo de la investigación.
2.2.1. Métodos, técnicas y procedimientos de análisis a Materiales de laboratorio
- Mechero - Erlenmeyer - Frascos ámbar - Embudos de separación - Papel filtro - Tubos de ensayo - Probetas - Balones de aforo - Varillas de vidrio - Pipetas - Vasos de precipitación - Gradillas
38 - Placas porta y cubre objetos
- Gillette - Gotero - Pinza b. Equipos - Microscopio - Sorbona - Estufa - Autoclave - Balanza analítica - Desecador - Horno mufla - Baño María c. Reactivo - Agua destilada
- Solución de peróxido de hidrógeno concentrado
- Ácido nítrico o solución de nitrato de amonio al 10 % m/v - Cloruro de metileno - NaSO4 anhidro - Agua peptonada - Hipoclorito de sodio a 10 ppm, - Acetona al 99,5% - Cloruro de sodio - Éter dietílico - Alcohol 96% - Reactivo de Sudan - Reactivo de Mayer - Reactivo de Wagner
39 - Reactivo de Liberman - Reactivo de Kedde - Reactivo de Fehling A - Reactivo de Fehling B - Tricloruro férrico al 5% - Ácido clorhídrico al 1%
- Ácido clorhídrico concentrado - Anhídrido acético
- Ácido sulfúrico concentrado - Alcohol amílico
- Hidróxido de sodio al 5 % - Cinta de magnesio metálica - Agar PCA - Agar Maconkey - Carboximetil celulosa - Ácido cítrico al 5% d. Muestra Muestra vegetal
- Hojas de planta zorrilla (Petiveria alliacea). 2.2.2. Estudio fitoquímico
a). Recolección
La planta zorrilla (Petiveria alliacea) fue recolectada en la Comuna de Chiguilpe ubicada a una altura de 625 m.s.n.m. perteneciente al Centro Cultural UNI-SHU de la Provincia de Santo Domingo de los Tsáchilas.
b). Comprobación taxonómica
Se tomaron 2 muestras completas de la especie en estudio y se identificó taxonómicamente en el Herbario Nacional del Ecuador.
40 c). Características organolépticas
Se realizó este análisis con el fin de determinar las características físicas de la materia prima, y de este modo conocer su sabor, textura, olor y color, parámetros que ayudaron para determinar las características de las hojas en el estudio.
d). Identificación micro morfológica (Cortes Histológicos)
Se realizó finos cortes transversales de la hoja y se procedió a colocar agua para la observación en el microscopio.
e). Determinación del contenido de Humedad: Método Gravimétrico Se Pesó 2g ± 0.5 mg de droga cruda,
Se colocar a una pesa filtro previamente tarada y se secó a 100 °C durante 3 horas.
La pesa filtro poner en un desecador donde se dejó enfriar hasta llegar a la temperatura ambiente y se pesó;
Colocar nuevamente en la estufa durante 1 hora y se repitió el procedimiento hasta obtener masa constante.
Cálculos:
%H= (M2-M1) / (M2-M)*100
Dónde:
H= Porcentaje de Humedad
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M1= masa de la pesa filtro con la muestra desecada (g). M2= Masa de la pesa filtro con la muestra de ensayo (g). 100= Factor matemático para los cálculos.
f). Determinación del contenido de cenizas totales
Calcinar previamente las cápsulas en la mufla a 600 ºC durante 2 horas, e introducir en el desecador hasta que alcanzan la temperatura ambiente y se pesan (P1). A
continuación se introducen en las cápsulas aproximadamente 2 g de muestra y se pesa de nuevo (P2). Se introduce en la mufla a 600 º C durante 2 horas. Trascurrido
dicho tiempo se llevan las cápsulas a un desecador hasta que alcancen la temperatura ambiente y se pesan (P3).
Cálculos
% Cenizas= (P3-P1) / (P2-P1)*100 P1= peso en gramos de la cápsula vacía
P2 = peso en g de la cápsula con la muestra
P3= peso en g de la cápsula con la muestra calcinada
g). Secado de las hojas de la planta zorrilla (Petiveria alliacea).
- Se recolecto las hojas y eliminar los cuerpos extraños. Posteriormente lavar abundante agua.
- Sumergir en agua con hipoclorito de sodio al 10 %, durante 10 minutos y dejar escurrir expuestos al sol por aproximadamente una hora.
- Se tritura las hojas secas, someter a un proceso de secado en una estufa a 35 º C durante 2 días.
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- Almacenar las drogas secas en fundas de papel estériles, que se introducen luego en recipientes herméticos para protegerlos de la luz.
h. Obtención de los extractos Tamizaje fitoquímico
De la muestra de ensayo previamente pulverizada y tamizada, pesa exactamente 50g y se transfirió a un matraz de 250mL, añadir 150mL de éter di etílico, dejándose en maceración durante 48h a temperaturas menores de 15 º C. Posteriormente se procedió a filtrar con papel filtro tarado, se midió el volumen y se calculó la concentración del extracto etéreo, el residuo se secó y pesó. A éste residuo se sometió a extracción con un volumen de etanol 70ºGL equivalente a tres veces el peso del residuo, el cual se dejó en maceración durante 48h a temperatura ambiente. Filtrar con papel de filtro tarado y el residuo se secó y pesó.
Realizar la extracción acuosa de este residuo con un volumen de agua equivalente a tres veces su peso, el cual se dejó en maceración durante 48h a Temperatura ambiente. Finalmente se filtrar con papel de filtro tarado y el residuo se secó y pesó. Anotar los pesos y realizar los cálculos.
Marcha fitoquímica.
Se realizó la identificación de los metabolitos secundarios haciendo uso de reactivos de coloración y precipitación. El extracto éter di etílico, se dividió en fracciones para la realización de los ensayos:
a). Ensayo de Mayer o Wagner: Extracción ácida:
Si la alícuota del extracto esta disuelta en un solvente orgánico este debe evaporarse en baño de agua.
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Si el extracto es acuoso a la alícuota se le añade 1 gota de ácido clorhídrico concentrado (calentar suavemente y dejar enfriar hasta acidez).
Se añadió una pisca de cloruro de sodio en polvo. Se Agito y se filtró.
Se añadió 2 o 3 gotas de solución reactiva Mayer Resultados
(+): Opalescencia (++) Turbidez definida (+++) Precipitado coposo
Para alcaloides cuaternarios y/o animo-óxidos se encontrarán en el extracto acuoso La reacción deberá ser (++) o (+++)
La reacción si es (+) se deberá a una extracción incompleta de bases. b). Ensayo de Dragendorff
Si la alícuota del extracto esta disuelta en un orgánico este debe evaporarse en baño de agua.
El residuo re disolverse en 1 mL de ácido clorhídrico al 1 % en agua
Si el extracto es acuoso a la alícuota se le añade 1 gota de ácido clorhídrico concentrado (calentar suavemente y dejar enfriar hasta acidez).
Con la solución acuosa acida de realiza el ensayo añadiendo 3 gotas del reactivo de dragendorff.
Resultados: (+): Opalescencia
44 (++) Turbidez definida
(+++) Precipitado
c).Ensayo de Shinoda:
Se realizó un extracto vegetal o acuoso
Extraer la alícuota, determinar si del extracto vegetal o acuosa para proceder (alcohol).
Diluir con 1 mL de ácido clorhídrico concentrado Añadir un pedazo de cinta de magnesio metálico. Esperar 5 minutos y añadir 1 mL de ácido amílico
Mezclar las fases y dejar reposar hasta que se separen. Resultados:
Positivo: Cuando el alcohol amílico se colorea (amarillo, naranja o rojo) intensos
d).Ensayo de Liberman-Buchard
Para triterpenos y/o esteroides, debe poseer un núcleo del androstano
Si la alícuota no se encuentra en cloroformo debe evaporarse el solvente en baño de aguay el residuo re disolverse en 1 mL de cloroformo.
Se adiciona 1 mL de anhídrido acético y se mezcla bien.
Por la pared del tubo de ensayo se deja resbalar 2-3 gotas de ácido sulfúrico concentrado sin agitar.
45 Resultados:
Rosado-azul muy rápido
Verde intenso-visible aunque rápido Verde oscuro-negro final de la reacción
e). Ensayo de Borntrager
Si la alícuota no está en cloroformo debe evaporarse el solvente en baño de agua y el residuo re disolverse en 1 mL de cloroformo.
Se adiciona 1 mL de hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o amonio al 5%. Se agita mezclando las fases y se deja en reposo hasta su ulterior separación. Resultados:
El ensayo es positivo cuando la fase acuosa alcalina se colorea de rosado, en este caso se reporta (++) o rojo, para lo cual se reporta (+++).
f). Ensayo de Baljet
Si la alícuota de la muestra a probar no está en alcohol, debe evaporarse el solvente en baño de agua y re disolverse en 1 mL de alcohol.
46 Resultados:
La prueba es positiva, cuando aparece una coloración o precipitado de color rojo (++) y (+++) respectivamente.
g). Ensayo de Espuma
Si la alícuota se encuentra en alcohol, se diluye con 5 veces su volumen en agua Se agita la mezcla fuertemente durante 5-10 min.
Resultados:
Se considera positivo si aparece espuma en la superficie del líquido de más de 2 mm de altura y persiste por más de 2 min.
h). Ensayo de cloruro férrico
A una alícuota del extracto alcohólico se le adiciona 3 gotas de una solución de tricloruro férrico al 5 % en solución salina 0.9%.
Si el extracto es acuoso se añade acetato de sodio para neutralizar y 3 gotas de una solución de tricloruro férrico al 5 % en solución salina 0.9%.
Resultados:
Un ensayo positivo puede dar:
Coloración rojo-vino compuestos fenólicos general. Coloración verde intensa, taninos de tipo pirocatecólicos. Coloración azul, taninos tipo pirogalotánicos.
47 i). Ensayo de Fehling
Si la alícuota del extracto no se encuentra en agua, debe evaporarse el solvente en baño de agua y el residuo re disolverse en 1-2 mL de agua.
Se adiciona 2 mL del reactivo y se caliente en baño de agua 5-10 min la mezcla. Resultados:
Se considera positivo si la solución se colorea de rojo o aparece precipitado rojo. j). Ensayo de Mucilagos
Una alícuota del extracto de agua se enfría a 0-5°C. Resultados:
- Si la solución toma una consistencia gelatinosa el ensayo es positivo.
2.2. Resultados
Características macro morfológicas organoléptica e identificación botánica de la planta zorrilla (Petiveria alliacea).
La evaluación macro morfológica es uno de los aspectos esenciales dentro del análisis de droga, puesto que ayuda a identificar posibles falsificaciones en el material vegetal. Los resultados obtenidos se presentan en el cuadro1 y 2.
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Cuadro 1 Características macro morfológica de las hojas de la planta Zorrilla
Ensayo Resultado
Hojas Simples con filotaxia alterna
Forma del contorno Elíptica a Oblanceolada,
Ápice Apiculado
Textura Membranosa
Base Redondeada , peciolada
Margen o borde Ondulado , de 7 a 9 cm de largo, 2 a 6 cm de ancho
Inflorescencias Racimos delgados, 10–35 mm.
Flores Subsésiles o en cortos pedicelos
Sépalos Blanco-verduzcos
Condición Fresca
Fuente: Laboratorio Físico- químico UNIANDES. Elaborado por: Cortez ,2016.
Cuadro 2 Características organolépticas de la planta Zorrilla.
Ensayo Resultado
Color Verde intenso
Olor Fuerte olor aliáceo.
Sabor Amargo
Fuente: Laboratorio Físico- químico UNIANDES. Elaborado por: Cortez ,2015.
49 a). Características microscópicas
La hoja presenta venación cerrada reticulada de tipo broquidódroma.
Fuente: Laboratorio de Biología, Universidad Técnica de Ambato, Facultad de Ciencias Agropecuarias. .
Elaborado por: Cortez ,2015
Tipo de venación de la hoja de, materia fresca. (1): vena primaria; (2): venación cerrada; (3): venas secundarias; (4): venación reticulada.
En el corte transversal del mesófilo, se observa que la epidermis es una estratificada, en ambas caras, aunque las células de la epidermis adaxial son más altas que las de la epidermis abaxial y presentan irregularidad en su estructura (Imagen 3 y 4).
Imagen 2 Tipo de venación de la hoja de la planta Zorrilla
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Fuente: Laboratorio de Biología, Universidad Técnica de Ambato, Facultad de Ciencias Agropecuarias. .
Elaborado por: Cortez ,2015
Corte transversal del mesófilo de la hoja de. (1): Epidermis adaxial; (2): parénquima lagunoso; (3): parénquima en empalizada; (4): tricomonas; Aumento: 40X.
Fuente: Laboratorio de Biología, Universidad Técnica de Ambato, Facultad de Ciencias Agropecuarias. .
Elaborado por: Cortez ,2015
Imagen 3 Estructura microscópica del Corte transversal del mesófilo de la hoja de la planta Zorrilla
Imagen 4 Estructura microscópica del corte transversal del mesófilo de la hoja de la planta Zorrilla
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Corte Transversal de la hoja de. Estructura de la hoja (1): células de epidermis adaxial; (2): células irregulares del mesófilo en empalizada. (3): Azul de metileno. Aumento: 40X
b). Identificación botánica
Se realizó en el Herbario Nacional del Ecuador. Los resultados se muestran en el cuadro 3.
Cuadro 3 Identificación taxonómica de la planta Zorrilla
Reino: Plantae Subreino: Tracheobionta División: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Subclase: Caryophyllidae Orden: Caryophyllales Familia: Phytolaccaceae Género: Petiveria Especie: Alliacea
Fuente: Herbario Nacional del Ecuador Elaborado por: Cortez, 2015.
c). Parámetros físicos químicos
Este procedimiento se realizó en materia vegetal cruda y se obtuvo los siguientes resultados:
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Tabla 1 Determinación de los parámetros físico-químicos de la planta Zorrilla
Ensayo Resultado Porcentaje
permitido USP # 28
Porcentaje de Humedad 9,90% Hasta 14%
Porcentaje de Cenizas
totales 10,42% Hasta 14%
Fuente: Laboratorio Físico- químico UNIANDES. Elaborado por: Cortez ,2015.
Los resultados expresados en la Tabla 1 nos indican que los valores obtenidos en porcentaje de humedad y cenizas, son adecuados dentro de las USP # 28, por lo que en porcentaje de humedad nos indica que las condiciones de almacenamiento son idóneas para evitar crecimiento bacteriano y degradación de metabolitos de la planta, además en el porcentaje de cenizas totales nos indica una buena recolección de la muestra.
Estudio químico cualitativo d). Tamizaje fitoquímico
Se realizó el tamizaje fitoquímico para determinar los principales grupos de metabolitos presentes en la especie. Los resultados se expresan en el cuadro 5, 6 y 7.
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Cuadro 4 Análisis Fitoquímico (Extracto Etéreo) de las hojas de la planta Zorrilla
Metabolitos Ensayo Extracto Etéreo
Aceites y grasas Ensayo de Sudan Negativo Alcaloides Ensayo de Mayer Opalescencia (+) Alcaloides Ensayo de Wagner Opalescencia (+) Triterpenos –Esteroides Ensayo de Liebermann-
Buchard
Verde intenso - visible aunque rápido Fuente: Laboratorio Físico- químico UNIANDES.
Elaborado por: Cortez ,2016.
Cuadro 5 Análisis Fitoquímico (Extracto alcohólico) de las hojas de la planta Zorrilla.
Metabolitos Ensayo Extracto alcohólico
Azucares Reductores Ensayo de Fehling Positivo Alcaloides Ensayo de Mayer Opalescencia (+) Alcaloides Ensayo de Wagner Opalescencia (+) Triterpenos –Esteroides Ensayo de Liebermann-
Buchard
Verde intenso visible aunque rápido Fenoles y taninos Ensayo de Cloruro
Férrico
Verde intenso
Resinas Ensayo de Resinas Negativo Saponinas Ensayo de espumas Positivo
Quinonas Ensayo de Borntrager Negativo Cardenólidos Ensayo de Kedde Negativo Fuente: Laboratorio Físico- químico UNIANDES.
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Cuadro 6 Análisis Fitoquímico (Extracto Acuoso) de las hojas de la planta Zorrilla
Metabolitos Ensayo Extracto acuoso
Azucares Reductores Ensayo de Fehling Positivo Alcaloides Ensayo de Mayer Opalescencia (+) Alcaloides Ensayo de Wagner Opalescencia (+) Flavonoides Ensayo de Shinoda Positivo
Mucilagos Ensayo de Mucilagos Negativo Saponinas Ensayo de espumas Positivo Principios Amargos Ensayo de Principios
Amargos
Positivo
Fuente: Laboratorio Físico- químico UNIANDES. Elaborado por: Cortez ,2016.
55 2.4. Conclusiones parciales del Capítulo II
La planta zorrilla (Petiveria alliacea) fue recolectada en el centro cultural UNI-SHU de la comuna de Chiguilpe de Santo Domingo de los Tsáchilas y se verifico en el herbario nacional del Ecuador que la planta en estudio pertenecía a la especie alliacea y al género Petiveria de ahí se le dio el nombre científico Petiveria alliacea.
Se elaboró diferentes ensayos y pruebas para obtener los metabolitos secundarios de las hojas de la planta zorrilla, comenzando con un estudio fitoquímico el cual consiste en la recolección, la comprobación taxonómica, la identificación de características organolépticas, microscópicas y la determinación del contenido de humedad y cenizas, posteriormente el tamizaje fitoquímico de la planta en estudio que consiste en la secado, macerado, posteriormente la marcha fitoquímica en la cual se realizó la identificación de los secundarios haciendo uso de reactivos de coloración y precipitación.
Finalmente se determinó que la planta Zorrilla contiene principios activos como alcaloides, taninos, flavonoides, azucares reductores saponinas lo que hace que tenga propiedades anestésicas, antisépticas, antibacteriana y antidiabéticas, mediante estas propiedades se derivó un jarabe natural principalmente hipoglucemiante, además se hizo el control de calidad del jarabe para evaluar su inocuidad.
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