En la presente Tesis Doctoral se llevó a cabo la inmovilización de la lipasa de
Rhizomucor miehei por unión covalente con sílice, previamente activada vía 2,4,6-tricloro- 1,3,5-triazina (TCT) (ver 1L4.6.).
Como ya se mdicó en la Introducción, los procesos de inmovilización por enlace covalente se desarrollan en dos etapas, ya que el proceso de activación del soporte se lleva a cabo en condiciones drásticas, que pueden alterar la estabilidad de la enzima. Las dos fases del proceso son:
a) activación de la sílice vía 2,4,6-tricloro-1,3,5-triazina (TCT) b) inmovilización de la enzima sobre sílice activada
La sílice utilizada
caracteristicas texturales:
fue Kieselgel 40 de Merck, que presenta las siguientes diámetro de partícula: 0,063-0,2 mm
superficie especifica 239 m2/g diámetro medio de poro: 9,5 A
volumen de poro acumulado: 0,57 cm3/g
m.s.i.- ACTIVACION DEL SOPORTE
La activación del soporte, sílice en este caso, se realizó por reacción con 2,4,6-tricloro- 1,3,5-triazina (TCT) (Esquema 23). La optimización de esta metodología fue llevada a cabo por miembros de nuestro grupo de trabajo266
+ cl N Activación de a sílice cl 2,4,b-tricloro..l,3.5-triazina
b-
O5
%
N INMovIUzAcIoN Enz-NH2 SJHEsquema 23: Activación de la sílice con 2,4,6-tricloro-1,3,5-tiiazina (TCT)
En un matraz se añadieron 25 g de Sílice, 250 ml de tolueno seco, 7,5 g de 2,4,6- tricloro-l,3,5-triazina y 15 ml de N,N,N-trietilamma La mezcla se mantuvo a reflujo a 60 0C
2
$....
OHSilice
durante 4h. A continuación, se procedió al lavado del soporte, para lo cual la sílice activada
se filtró a vacio con un embudo Euchner y se lavó con 250inI de tolueno seco y con acetona previamente pura hasta que la sílice se decoloró.
IiLLS.l.a.- Medida del 2rado de activación
El grado de activación de la sílice se midió en función del tanto por ciento de TCT unida, para lo cual se hizo una determinación de cloruros tanto del soporte activado como en los líquidos de lavado siguiendo el método de Mobi967
Para la valoración de los cloruros de los liquidas de filtrado se tomaron 5 ml de dichos líquidos, se añadieron 10 ml de NaOH (0,1 M> y la mezcla se agitó durante 5 min. A
continuación, se separaron ambas fases en una ampolla de decantación y se repitió el proceso
dos veces más. Posteriormente, se unieron las tres fases acuosas, de las cuales se tomó 1 ¡nl, que se mezcló con tampón fosfatolNaOH (0.1 M) pH= 7,0 y con 0.05 g de K2CrO4, valorandose la mezcla con una disolución de AgNO3 (0,IM), hasta la formación de un precipitado rojo de Ag2Cr2O4.
Para la valoración de los átomos de cloro remanentes en el soporte activado se tomaron 0,1 g de éste y se tuvieron en agitación, durante 2 h a temperatura ambiente, con 10 ml de NaOH (0,1 M). A continuación, se tomó 1 ml de la disolución y se valoraron los inoes cloruro de forma análoga al caso anterior. En los dos casos se hicieron ensayos en blanco para determinar la posible existencia de cloruros en el disolvente organico, solucion de NaOH, tampon, etc.
111.5.2.- LNMOVTILIZACION DE LA LIFASA DE Rhizomucor iniehel
En la presente Tesis Doctoral se inmovilizaron la lipasa de Rh.miehei cruda (Lipozymet IOOOOL) y semipurificada por precipitación con un 50% de saturción de sulfato amónico, ya que éste fue el proceso de semipurificación con el que se obtuvieron mejores resultados. El procedimiento seguido con ambas enzimas fue el mismo.
Procedimiento experimental
Se preparó una disolución (5,16 mg proteína/mi) de lipasa cruda de Rltmiehei en tampón Tris-HCl (0,lM) pH= 8,0. En el caso de la lipasa seniipurificada el precipitado
obtenido se disolvió en el mismo tampon.
11 g de sílice activada y 100 ml de la disolución de lipasa se agitaron, durante 49 h a 4 oc,. A continuación, se filtró a vacío con un embudo buchner y el residuo se lavó con tampón Tris-HCI (0,IM) pH 8,0 hasta que los líquidos de lavado dieron negativo el ensayo del Biuret, es decir, hasta que no hubo proteínas en los líquidos de lavado.
11I.5.l.a.- Determinación de la carra protéica del derivado
La carga protéica del derivado inmovilizado se determinó por diferencia entre el contenido protéico de la disolución enzimática inicial y los liquidos de lavado. El método de determinación protéica utilizado fue el método del biuret <ver 11L3.La.)
ll1.&2.b.- Determinación de la actividad retenida del derivado
Para calcular el porcentaje de actividad retenida se hizo un ensayo estándar de actividad lipásica con tributirina (ver III? 3.3.b.) ala disolución enzimática inicial y al derivado inmovilizado, La actividad lipásica, obtenida en cada ensayo, se expresó por miligramo de proteína con fines comparativos. La concentración protéica de la disolución enzimática inicial se detenninó por el método del Biuret y la concentración protéica del denvado inmovilizado se determinó en función de la carga enzimática calculada anteriormente.
11115.3.- ESTUDIOS DE ESTABILIDAD TERMICA DE LOS DERIVADOS INMOVILIZADOS
Para estudiar la estabilidad térmica de los derivados inmovilizados obtenidos, frente
a la enzima cruda y semipurificada de Rh.rnieheí, se almacenaron tanto los derivados como
las enzimas a 37 y 50 0C. A continuación, se analizó la actividad lipásica de cada uno de ello, tras un determinado tiempo de almacenaje, haciendo ensayos de hidrólisis de tributirina (ver
fIL 3.3.b.)
Procedimiento experimental
El medio utilizado para almacenar las enzimas presentaba la misma composición de sales inorgánicas que el emulsificante en el que se preparó el sustrato de la reacción de hidrólisis de tributirina, es decir 1,8 g de NaCí y 0,041g de KH2PO4 completando con agua
hasta iOOmi.
Las lipasas cruda y semipurificada de Rh.miehei se diluyeron en el medio de almacenaje y se mantuvieron a 50 y 37 0C, analizando su actividad lipásica cada cierto tiempo.
Para analizar la estabilidad de los derivados inmovilizados se prepararon pequeñas muestras (2 por cada tiempo estudiado) con 50 mg de derivado y 0,2 ml del medio de almacenaje. Estas muestras se almacenaron a 50 y 37 0C de temperatura durante un determinado tiempo, tras el cual se analizó su actividad lipásica remanente.
m.5.3.a.- Ajuste estadístico de las curva de termoestabilidad obtenidas
La actividad lipásica obtenida tras un determinado tiempo de almacenaje a 37 y 5ú