HEPÁTICA ∗
L. DATOS ANÁLISIS IMMUNOHISTOQUÍMICO DE LA ENFERMEDAD HEPÁTICA ∗
5. Marcador stem cell CD166 membrana (CD166, 35264, CD166 LYO 1 ml (mililitre)
EpCAMhigh-CD166+, A. Menarini Diagnostics®)
o Negativo: 0
o Positivo: 1
Todos los datos del análisis histológico e inmunohistoquímico de la enfermedad hepática, han sido referentes a la pieza quirúrgica obtenida tras realizar la primera hepatectomía186, 187.
El análisis histológico convencional56, 195 se ha realizado mediante fijación en parafina del
tejido con paraformaldehido (PFA) al 4% durante al menos 24 horas y posterior tinción con hematoxilina eosina13, 173, 178, 183, 187, 189, 190, 216, 218, 219. Hemos realizado cortes desde el centro hasta la
periferia de la lesión con un grosor de 5 mm. en la/s MH173, 178, 183, 184, 186, 189, 190, seleccionando cortes
de todas las áreas macroscópicamente significativas. Si en la pieza quirúrgica obtenida tras realizar la hepatectomía en un paciente, existían más de una MH, se procedió al análisis histológico e
inmunohistoquímico, una por una, de todas las MHCCR presentes173. Hemos empleado un
microcópio óptico convencional multilente Carl Zeiss Axioskop 40® (×25, 40, ×100, ×400 y
×1000 aumentos)195.
Tanto el número como el tamaño de las MHCCR son parámetros definidos clásicamente en el estudio anatomopatológico en la mayoría de las series4, 5, 9-12, 15, 16, 18, 28, 30, 32, 35, 38, 40, 41, 43, 45, 47, 48, 50, 52-54, 56, 58, 73, 79, 144, 145, 147-153, 155-158, 195.
La descripción del mínimo margen de resección respecto del borde de avance tumoral medido en milímetros, es una constante dentro del estudio histológico de la literatura actual3, 8-10, 12, 25, 29, 43, 47, 50, 53, 56-66, 133, 136-142, 183, 195, 377, 394-398 .
La resección R1 la hemos definido como aquella en la que se mostraba presencia
microscópica de tumor en el estudio histológico con una distancia libre o con un márgen de
resección <1 mm.195, en base a la clasificación ya comentada anteriormente y seguida por
numerosos autores25, 56, 138, 140, 173, 183, 393, 394. No fueron incluidos en nuestro estudio pacientes con
resecciones R2 (resecciones hepáticas con márgenes macroscópicamente afectados).
Para la detección de los microsatélites en el parénquima adyacente, en nuestra serie empleamos múltiples cortes en la periferia de la lesión principal13, 195, considerando microsatélites a
todo foco neoplásico situado a más de 5 mm. del borde de avance tumoral y exigimos que la lesión
principal no tenga continuidad con el microsatélite56, 195, 398-400. En presencia de lesiones
microsatélite, para calcular la distancia libre de tumor, tomamos como punto inicial el límite de la lesión satélite56, 195, 398-400.
Las características del margen tumoral13 en cuanto a su patrón de cremiento expansivo o
infiltrante, ya ha sido estudiado por nuestro grupo anteriormente195.
Basándonos en el axioma195: “…a mayor diámetro nuclear, mayor número de aberraciones
cromosómicas…”, el grado nuclear hace refencia al número de veces que es mayor el núcleo celular
de la célula neoplásica respecto al núcleo del linfocito peritumoral, célula de referencia tomada arbitrariamente por su sencilla mesura (7 micras)195. Nosotros hemos usado un grado nuclear ≥3
en base a la literatura actual revisada195.
Tanto el grado nuclear como el grado de diferenciación tumoral, hacen referencia a la anaplasia e indiferenciación celular195, por lo que también la hemos recogido en nuestro análisis.
Bien diferenciado: cuando el tumor forma >90% de glándulas; Medianamente diferenciado: cuando el tumor forma entre el 50% y el 90% de glándulas; Poco diferenciado: cuando el tumor forma <50% de glándulas; Indiferenciado: cuando el tumor no forma glándulas.
La forma de cuantificar la actividad celular tumoral en las MHCCR es reflejar en nuestro estudio histológico el nº mitosis/mm.2 195. Hemos usado un nº mitosis/mm.2 ≥10 en base a los datos ya publicados por nuestro grupo195.
Para estudiar la eficacia de la QT, hemos valorado la respuesta histológica en base al porcentaje de fibrosis y de células viables residuales tumorales de igual modo a como realizó el
grupo de Rubbia-Brandt et al178. También hemos determinado el porcentaje de necrosis tumoral.
Según lo definido por otros grupos de trabajo178, 183, 187, la proporción de tumor viable en la
MHCCR ha sido calculada como una suma semicuantitativa173, 219 de proporciones (porcentajes
respecto del 100% del área o de la superficie de la MHCCR). La suma proporcional de necrosis, fibrosis y de células viables tumorales dará como resultado ese 100%. Para la necrosis hemos empleado el punto de corte del 50% que ha sido usado también por el grupo de Rubbia-Brandt et al178. Para la fibrosis el punto de corte ha sido el 40% empleado por Poultsides et al187. Para la
presencia de celularidad tumoral viable el punto de corte ha sido el 10%, que es el mismo
También hemos querido investigar si la presencia de pseudocápsula fibrosa
peritumoral401 ha influido o no en la supervivencia y/o recurrencia de nuestros pacientes, con el
objeto de completar los resultados preliminares publicados recientemente por nuestro grupo195.
Hemos considerado la existencia de una pseudocápsula fibrosa en base al estudio de Lunevicius et al401 que considera a las MHCCR como encapsuladas si existe una reacción fibrosa con un espesor
regular igual o mayor a 0.5 mm en todo el contorno de la MH.
Patrón crecimiento peritumoral hemos diferenciado entre un patrón hipóxico y otro no
hipóxico216-218, 402. La hipoxia tumoral se considera un factor pronóstico de recidiva precoz en el
siendo característica de muchos tumores sólidos localmente avanzados403-407 incluido el CCR216 y
las MHCCR218. La hipoxia y la angiogénesis se muestran asociados a una mayor agresividad
biológica tumoral, resistencia al tratamiento y un peor pronóstico173, 218, 408.
El término Tumor Normal Interface (TNI) está basado en el hecho de que el mayor número de células viables residuales se encuentra en la periferia del tumoral y hace referencia al máximo espesor de la periferia tumoral en el cual existe el mayor número de células viables residuales tras la administración de QT neoadyuvante173, 219. Nosotros hemos denominado a este
nuevo parámetro histológico con un término equivalente, el casquete tumoral. Hemos definido el casquete tumoral-TNI, como la mayor distancia, en milímetros, entre la zona central necrótica de la MH y el borde de la misma con interfase de hígado sano, en la cual tras realizar múltiples cortes se evidenció la presencia de células tumorales viables173, 219. El valor que hemos empleado ha
En cuanto al análisis inmunohistoquímico, lo hemos realizado mediante la técnica tisssue microarray (TMA o microarrays de tejidos)195, 216-218, 409-411, que permite estudiar simultáneamente
diferentes marcadores inmunohistoquímicos (moleculares) en un acto único con una estandarización del proceso y un ahorro en términos temporales y económicos195, 412. Mediante esta
técnica, hemos estudiado la expresión inmunohistoquímica de los marcadores tumorales definidos previamente195, 410.
Un microarray está formado por numerosos puntos, cada uno de los cuales representa fragmentos tumorales de un paciente. Mediante un aparato específicamente diseñado para este proceso (Beecham Instruments Tissue Arrayer®)195, 410, 411 que se acopla a diferentes agujas, se
transfieren cilindros de tejido procedentes de áreas morfológicamente representativas de diversos bloques de tejido “donantes”, a un único bloque de parafina “receptor”. El TMA puede contener, desde decenas hasta cientos de cilindros, dependiendo del diámetro de las agujas utilizadas para su obtención195, 410, 411. Estos cilindros se encuentran cuidadosamente ordenados en filas y columnas
que permiten su localización195.
Nosotros, hemos realizado 3 microarrays de tejidos que se han compuesto de 60 a 90
fragmentos tumorales seleccionados previamente de cada paciente195. Estos fragmentos,
corresponden a las zonas más infiltrantes y representativas del tumor. De cada paciente, hemos incluido al menos, dos fragmentos tumorales, todos ellos, de 1.5 mm. de diámetro195. Mediante la
TMA, hemos estudiado los tumores de 60 en 60, en vez de uno en uno195.
Hemos empleado la técnica de tinción inmunohistoquímica mediante el método indirecto195. En él, el anticuerpo específico contra la sustancia que se quiere detectar (en nuestro
caso, proteínas), está marcado con partículas detectables al microscopio óptico195. El protocolo
estandar del método inmunohistoquímico indirecto, que hemos realizado, consiste en los pasos siguientes195:
1.- Fijación del tejido o las células con paraformaldehido (PFA) al 4% durante unas horas. 2.- Crioprotección del tejido en sacarosa al 30% en tampón fosfato (PB) 0.1M a 4ºC toda la
4.- Inmunoreacción: Para eliminar la actividad de las peroxidasas endógenas, el tejido se preincuba en una solución de 0.3% H202 en metanol durante 20 minutos (este paso no es necesario en el caso de técnicas de inmunofluorescencia)∗.
Se ha realizado la revisión de las muestras de nuestros pacientes, con técnicas de tinción de hematoxilina eosina195 y correlativamente, se han identificado en el núcleo (p-53 y Ki-67)195 y en la
tinción de la membrana celular (CD44, CD133 y CD166)195, la tinción significativa de cada uno de
los marcadores definidos en nuestro estudio:
p53 Protein, code IS616, Clone DO-7, Ready-to-Use, FLEX, for Dako® Autostainer Instruments, Dako®.
Ki-67 Antigen, code IS626, Clone MIB-1, Ready-to-Use, FLEX, for Dako® Autostainer Instruments, Dako®.
CD133, SC-130127, CD133 (32AT1672), Santa Cruz Biotechnology®, Inc.
CD44, EpCAMhigh-CD44+, Santa Cruz Biotechnology®, Inc.
CD166, 35264, CD166 LYO 1 ml (mililitre) EpCAMhigh-CD166+, A. Menarini Diagnostics®.
Se han identificado en el núcleo (p-53 y Ki-67) con un valor umbral de corte del 10%195, en
el citoplasma (CD166) y en la tinción de la membrana celular (CD44, CD133 y CD166), la tinción significativa de cada uno de los marcadores stem cell con valor umbral de corte>15%195.
Hemos empleado el Sistema DAKO®∗∗186, 195, 216-218 automatizado de tinción, que nos
permite un control objetivo de la técnica, evitando variaciones aleatorias∗∗∗.
∗a) Lavar 2 veces, 10 min., en tampón fosfato salino (PBS) 0.1M a pH 7.4 conteniendo 0.25% Triton (PBST); b) Preincubar durante 30 min. con PBST conteniendo 1% de suero de albumina bovina (BSA), a fin de reducir el marcaje inespecífico; c) Incubar durante una noche a 4ºC con el anticuerpo primario específico contra la sustancia que queremos detectar (los anticuerpos siempre se diluirán en la solución PBST-BSA); d) Lavar las secciones con PBST 2 veces, 10min.; e) Lavar 2 veces, 10 min., con PBS; f) Incubar las secciones durante 1 hora a temperatura ambiente; g) Lavar 1 vez, 10min., con tampón Tris-HCl 0.1M pH 7.2; h) Incubar las secciones en una solución de 3,3´-diaminobezidina tetrahydrochloride (DAB) al 0.05% en tampón Tris-HCl conteniendo 0.025% de H202 durante 5 a 10 min. La duración de las incubaciones y lavados dependerá del grosor del corte entre otros factores.
∗∗
El Sistema Dako automatizado de tinción empleado ha sido el DakoCytomation Autostainer Plus®. El microscopio óptico
empleado ha sido el Carl Zeiss Axioskop 40®.
∗∗∗Hemos buscado la concentración/dilución de entrada óptima para cada marcador de célula madre (anticuerpo),
La proteína p53 es el controlador del ciclo celular por excelencia y se encarga fundamentalmente de que ninguna célula con alteraciones importantes en su DNA complete el ciclo celular72, 79, 192-195. Tiene un papel transcendental dentro de la carcinogénesis del cáncer de
colon, especialmente en los carcinomas ligados a la vía supresora, la más importante desde el punto de vista cuantitativo195. Generalmente se detecta p53+ cuando la p53 es anormal y permite
que las células alteradas genéticamente (tumorales), eviten la apoptosis o muerte celular195.
El Ki-67 es un anticuerpo monoclonal contra un antígeno nuclear que marca todas las células que están dentro del ciclo celular activo (fuera de la fase G0), no sólo las que se encuentran
en mitosis195. Su expresión esta directamente relacionada con la capacidad de crecimiento del
tumor72, 195, 196. De forma cuantitativa, expresa el índice de proliferación celular en determinados
tipos de tumores como el adenocarcinoma colorrectal72, 195, 196, 218.
El antígeno de superficie CD133, es una glicoproteína de la membrana celular, considerado un marcador de superficie celular expresado en células inmaduras hematopoyéticas pero no en células maduras sanguíneas. Además, el CD133 ha demostrado ser un marcador para células progenitoras neuronales inmaduras. Es reconocido por dos anticuerpos, el CD133/1 o AC133
(que es el que hemos utilizado nosotros)195 y el CD133/2 (AC141). Las células CD133+ en el
CCR, son marcadores útiles para la detección de células madre (stem cells)72, 195, 197-201.
El CD44, se considera un marcador de membrana celular o molécula de adhesión de
células epiteliales (EpCAM). Su fenotipo EpCAMhigh-CD44+, está estableciéndose como un buen
marcador de células madre de la mucosa del colon humano en determinadas series72, 195, 197-201.
El CD166, se considera un marcador tanto de membrana celular o molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM), como citoplasmático. Es un marcador de stem cells mesenquimales cuya función en la génesis del cáncer no está del todo clara72, 195, 197-201. Su fenotipo
EpCAMhigh-CD166+ sumado al EpCAMhigh-CD44+, se está empezando a considerar como un