Marcadores moleculares

En esta tesis hemos utilizado y desarrollado diferentes tipos de marcadores moleculares para la detección y mapeo fino del locus ETHQV6.3. A continuación se describirán los marcadores moleculares utilizados y cuando corresponda, cómo se desarrollaron.

3.4.1 AFLP (“Amplified Fragment Length Polimorphism”)

La metodología AFLP se aplicó según el protocolo original de Vos et al. (1995) con pequeñas modificaciones, se sustituyó la enzima EcoRI por PstI. A pesar de que

EcoRI produce un mayor número de polimorfismos que PstI, distintos estudios

muestran como los polimorfismos originados mediante el uso de EcoRI tienden a localizarse formando clusters en las regiones centroméricas mientras que en el caso de PstI los polimorfismos se distribuyen de una forma más homogenea cubriendo las zonas distales de los cromosomas (Vuylsteke et al.1999).

A continuación se describen las cuatro etapas principales en el proceso de obtención de los marcadores AFLP.

Digestión del DNA

El DNA genómico (500 ng) fue digerido con dos enzimas de restricción: uno de corte frecuente, MseI (diana de restricción: TTAA) y otro de corte poco frecuente, PstI (diana de restricción GACGTC).

Ligación de los adaptadores

Tras la digestión del DNA se ligaron adaptadores específicos a los sitios creados por los enzimas de restricción. Las secuencias de los adaptadores se encuentran en los apéndices A.4 y A.5.

Amplificación del DNA

Las amplificaciones se llevaron a cabo en dos etapas: (1) amplificación preselectiva de todos los fragmentos generados durante la digestión y ligación de los adaptadores y (2) amplificación selectiva de los fragmentos originados por el uso de cebadores Pst y Mse con dos y tres bases adicionales respectivamente.

En la primera PCR se utilizaron cebadores complementarios a los adaptadores Pst y Mse añadiendo una base adicional (A, T, C y G), MseI+1 y PstI+1 (Apéndices A.4 y A.5).

La segunda amplificación o amplificación selectiva utiliza los mismos cebadores pero con dos nucleótidos más en el extremo 3’ del cebador MseI+1 (MseI+3) y uno en extremo 3’ del cebador PstI+1 (PstI+2). Se analizaron 1024 combinaciones utilizando 64 cebadores MseI+3 y 16 PstI+2.

Visualización de los fragmentos AFLPs

Los fragmentos de PCR amplificados y marcados radioactivamente fueron separados mediante electroforesis vertical en geles desnaturalizantes de acrilamida. Tras la amplificación se añadió a cada muestra 10 µl de tampón de carga (95 % de formamida desionizada, EDTA 10 mM pH 8.0, 0.01 % xilencianol, 0.01 % azul bromofenol) y se desnaturalizaron a 96ºC durante 10 min.

Se cargaron 4 µl de las muestras en geles de acrilamida al 6 % (19:1 acrilamida/bisacrilamida, urea 7.5 M, 0,005 % persulfato de amonio, 0.1% TEMED y tampón TBE 1x) y se corrieron las muestras durante 90 min a 100 W. Después de la electroforesis, el gel fue transferido a un papel Whatman 3MM, secado al vacio y expuesto a un film fotográfico AGFA Curix RP2 durante dos días. Pasado este tiempo, el film fue revelado y se analizaron los patrones de bandas.

Asilamiento y purificación de los fragmentos AFLP

Las bandas de interés se recortaron del papel Whatman en el que se había secado el gel y se rehidrataron con 30 µl de agua estéril durante toda la noche a 4ºC. Se tomaron 2 µl para la amplificación de los fragmentos AFLP utilizando los mismos cebadores y condiciones de la segunda PCR selectiva. Estas bandas fueron visualizadas en geles de agarosa al 2 % a partir de los cuales fueron aisladas y purificadas mediante el kit de purificación QIAquick de Qiagen (QIAGEN INC., Chatsworth, CA: Cat No. 28104) para su clonaje en el vector pGEM-T “Easy Vector System™” (Promega, Branford, CT, EE.UU) y su posterior secuenciación.

3.4.2 Microsatélites o SSR (“Simple Sequence Repeats”)

Los microsatélites utilizados en esta tesis provenían de: (1) EST y estaban descritos en la literatura (Diaz et al. 2011) y recogidos en la bases de datos de ICuGI (https://icugi.org), (2) desarrollados a partir de genotecas genómicas (Fernandez-Silva et al. 2008a) y (3) fueron facilitados por otros grupos de investigación. Durante el transcurso de esta tesis se desarrollaron nuevos SSRs a partir de la secuencia del genoma del melón (Garcia-Mas et al. 2012) en la región de la introgresión de SC en el GL VI usando el buscador de secuencias repetitivas “Tandem Repeat Finder”

(http://tandem.bu.edu/trf/trf.html) (G. Benson 1999) y se diseñaron cebadores flanqueando las repeticiones con Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) (Rozen 2000). Todos los microsatélites, sus cebadores y condiciones de amplificación aparecen listados en la tabla A.1 del apéndice.

La temperatura de hibridación óptima (Tan) de aquellos marcadores desarrollados durante esta tesis se obtuvo tras realizar una PCR de gradiente utilizando muestras de PS y SC. Las reacciones de PCR se realizaron en volumen final de 15 µl con tampón Lab 10x [15 mM (NH4)2SO4, 100 mM Tris-HCl, 500 KCl, gelatina 0.01 %], 1.5-3.5 mM MgCl2, 166 µM dNTPs, 5 pmol de cada cebador, 2 U Taq y 20 ng de DNA. Las condiciones de amplificación fueron: un ciclo inicial a 94º durante 1 min, seguido de 35 ciclos a 94ºC durante 30 s, temperatura de hibridación 40-60º durante 30 s, 72ºC durante 1 min y un ciclo final a 72ºC 5 min. La visualización de los fragmentos se realizó mediante electroforesis en geles de agarosa al 2 %. A uno de los cebadores de cada par se le añadió en el extremo 5’ la secuencia de veinte nucleótidos del vector M13 (5’ CACGACGTTGTAAAACGACC 3’) para la visualización mediante fluorescencia en un secuenciador automático.

El genotipado de las distintas poblaciones utilizadas en esta tesis se realizó mediante PCR en las mismas condiciones descritas anteriormente y a la temperatura de hibridación óptima para cada par de cebadores pero añadiendo 2 pmol de cada cebador y 0.66 pmol de oligonucleótidos marcados con IRD700 o IRD800 complementarios a la secuencia de 20 nucleótidos del M13. Los fragmentos amplificados fueron visualizados en un secuenciador vertical tipo LI-COR IR2 _(Li-Cor Inc, Lincoln, Nebraska, USA). Las electroforesis fueron realizadas en condiciones desnaturalizantes a 50 ºC en tampón TBE 1x (90 mM Tris-borato, 2 mM EDTA pH 8,0) y 7.5 M urea en geles de poliacrilamida al 6 % (AccuGelTM 19:1/ Sequencing Grade; National Diagnostics).

3.4.3 CAPS (“Cleaved Amplified Polymorphic Sequence”)

Los marcadores de tipo CAPS (Konieczny and Ausubel 1993) se caracterizan por la detección del polimorfismo mediante digestión con un enzima de restricción. Los marcadores fueron amplificados mediante PCR en un volumen final de 25 µl que

contiene tampón Lab 10x [15 mM (NH4)2SO4, 100 mM Tris-HCl, 500 KCl, gelatina 0.01 %], 1.4 mM MgCl2, 200 µM dNTPs, 400 µM de cada cebador y 3 U de Taq DNA polimerasa. Las condiciones de amplificación fueron las mismas que las utilizadas con los SSRs. La digestión con la enzima de restricción se llevo a cabo en un volumen final de 20 µl que contenía: 2 µl de tampón de la enzima 10x, 2.5 U del enzima, 10 µl del producto de PCR, siguiendo las instrucciones del fabricante del enzima. El producto de la digestión fue separado mediante electroforesis en gel de agarosa al 2 %. En la tabla A.1 del apéndice se encuentran las condiciones y enzimas para cada marcador de tipo CAPS utilizado.

3.4.4. Mapeo de los nuevos marcadores

El programa MAPMAKER 3.0 (Lander et al. 1987) fue utilizado para cartografiar el locus ETHQV6.3 en la población 2008-F2 de 152 individuos. El cartografiado genético de los nuevos marcadores desarrollados en la población 2010-F2 se llevó a cabo utilizando los eventos de recombinación respecto al locus ETHQV6.3. Las distancias físicas fueron directamente obtenidas a partir de la secuencia del genoma del melón.