Corporation). Finalmente, se graficó el porcentaje de recuperación de fluorescencia en función del tiempo de acuerdo a la siguiente fórmula: F(t)=(FRDI/FRDR)/(FpreRDI/FpreRDR)×100, donde FpreRDR es la intensidad de fluorescencia de RDR antes del foto-blanqueado, FRDR es
la intensidad de fluorescencia de RDR al tiempo t, FpreRDI representa la intensidad de RDI antes del foto-blanqueado y FRDI es la intensidad de fluorescencia de RDI al tiempo t. Cabe
destacar que sobre las células analizadas se realizaron ensayos de inmunofluorescencia empleando el anticuerpo monoclonal que reconoce myc, para determinar la co-expresión de Rab1bQ67L-myc.
Para realizar los ensayos de FRAP en células que expresan GFP-Sec16, se utilizó el microscopio de fluorescencia confocal Olympus FluoView 300 (Sistema Nacional de Microscopía). La recuperación de la fluorescencia se monitoreó escaneando cada 3
segundos a una intensidad de láser del 0.05%. Se calculó el promedio de las intensidades
de fluorescencias empleando el software ImageJ.
8. Determinación de niveles de transcripto
8.1 Purificación de ácido ribonucleico (ARN) total de células eucariotas en cultivo
Células provenientes de una placa de 60 mm se lavaron 3 veces con PBS 1X (solución salina de fosfatos) y se lisaron con 1 mL de TRIzol (Invitrogen). El protocolo de purificación de ARN
se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, luego de la lisis con TRIzol, el homogeneizado se incubó 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se
adicionaron 200 μL de cloroformo por cada mL de TRIzol empleado, se agitó vigorosamente
durante 15 segundos y se incubó por 2-3 minutos a temperatura ambiente. La muestra se
centrifugó a 12000 x g por 15 minutos a 4°C. De las 2 fases resultantes el ARN permanece exclusivamente en la fase acuosa (superior), por lo que dicha fase se transfirió a un nuevo
tubo y el ARN se precipitó empleando 0,5 mL de isopropanol 100% por cada mL de TRIzol
utilizado, se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. El pellet obtenido se centrifugó a 12000 x g por 10 minutos a 4°C. Se descartó el sobrenadante y se lavó con 1 mL de etanol 75% por cada mL de TRIzol utilizado, se agitó suavemente empleando vortex y se centrifugó a 7500 x g por 5 minutos a 4°C. Se descartó el sobrenadante y nuevamente se centrifugó a 7500 x g por 5 minutos a 4°C para eliminar los restos de alcohol. El ARN precipitado se secó a temperatura ambiente y se resuspendió en 20-30 μL de agua libre de ARNasas (GIBCO). Las muestras se conservaron a –80°C hasta su análisis.
La concentración del ARN se determinó mediante la lectura de la absorbancia a 260
nm, sabiendo que 1 DO260 equivale a 40 µg/mL de ARN. La pureza se evaluó a través de la relación de absorbancias obtenidas a 260 y 280 nm, leídas en el lector de multiplacas Biotek, considerándose valores aceptables entre 1,8 y 2.
Mat. y Met.
La integridad del ARN se evaluó a través de la visualización de una alícuota en un gel de
agarosa desnaturalizante (1,2% de agarosa y 1,1% de formaldehído en buffer MOPS). Para ello se sembró en dicho gel una mezcla de 2,5 μL de muestra junto con 5,6 μL de formamida deionizada, 2 μL de formaldehido, 1,1 μL de buffer ácido 3-(Nmorfolino) propanesulfonico (MOPS) y 1 μL de Bromuro de Etidio; previamente incubada por 10 min a 65°C a fin de destruir estructuras secundarias. La corrida se realizó durante 30 minutos a 80V y se visualizó en transiluminador. Se consideró que la muestra tiene integridad adecuada cuando la relación de intensidad entre las bandas correspondientes a la subunidad 28S respecto a la 18S es
cercana a 2.
8.2 Reacción de Transcripción Reversa: Conversión de ARN a ácido desoxirribonucleico copia (ADNc)
La síntesis de ADNc se realizó a partir de 1 µg de ARN purificado en un volumen final de 20 µL. Tubos conteniendo 1 µg de ARN se incubaron con 1 U/µl de inhibidores de ribonucleasas RNasin (Promega), 4 µL de buffer de reacción comercial 5X (Promega), 0,25 µg de una mezcla de hexadeoxinucleótidos de secuencias al azar (cebadores de la transcriptasa reversa, Random Primers - Promega) y cantidad necesaria de agua libre de ARNasas (GIBCO), a 65°C durante 15 minutos para destruir estructuras secundarias. La mezcla se enfrió
inmediatamente en hielo para evitar la regeneración de dichas estructuras. Posteriormente
se agregó 1 mM de cada desoxirribonucleótido trifosfato (dNTPs - Invitrogen) y 10 U/µL de la enzima M-MLV transcriptasa reversa (Promega) y la mezcla se incubó a 37°C por 60 minutos. Finalmente la reacción se inactivó a 95°C durante 3 minutos.
8.3 Amplificación semicuantitativa de ADNc de β-Actina por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
A fin de corroborar la síntesis adecuada de ADNc, se realizó una PCR para amplificar un fragmento característico del ADNc correspondiente al ARNm del gen que codifica a la proteína β-Actina, utililizado como control de carga endógena. Para ello se preparó una mezcla de reacción conteniendo 2 μL de buffer de reacción comercial 10X (Invitrogen), 1,5
mM de MgCl2 (Invitrogen), 250 μM de cada dNTP (Invitrogen), 1,5 U de Taq polimerasa (Invitrogen), 1 μM de los cebadores correspondientes a β-Actina (Sigma-Aldrich), 10 μL de
una dilución 1/5 del ADNc obtenido en el ensayo de transcripción reversa descripto en el
ítem anterior y cantidad necesaria de agua libre de ARNasas (GIBCO) para un volumen final de 20 μL. El protocolo de ciclado se realizó en un termociclador MULTIGENE de LabMet y consistió en un paso de desnaturalización de 5 minutos a 95°C; seguido por 30 ciclos de 95°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos y 72°C por 30 segundos; la extensión final fue de 10 minutos a 72°C. Finalmente se observó el fragmento amplificado de 138 pares
de bases (pb) en gel de agarosa al 2%. En cada ensayo de PCR se incluyeron los controles
Mat. y Met.
8.4 Amplificación cuantitativa de ADNc por PCR a tiempo real (qPCR)
Los pares de cebadores utilizados en esta tesis para amplificar las secuencias de interés
se eligieron considerando que la hibridación de cada uno de ellos sea en diferentes exones
para evitar amplificar ADN genómico además de ADNc, que su tamaño sea entre 50 y 250 pb, que no forme dímeros estables (IΔGI ≤ 6) y que la temperatura de hibridación de ambos sea cercana a 60°C y no difiera más de 1°C entre ellos. El diseño y la evaluación teórica de los cebadores utilizados se realizó manualmente con la ayuda de los programas Primer-BLAST (Ye et al. 2012) y NetPrimer (PREMIERBiosoft International, http://www.premierbiosoft.
com/servlet/com.pbi.crm.clientside. FreeToolLoginServlet). La secuencia de los cebadores empleados se indica en la Tabla 1.
Tabla 1. Secuencia de los cebadores empleados en los ensayos de qRT-PCR. Se detalla la