Material Vegetal

Para los distintos tratamientos se utilizaron hojas maduras y jóvenes de Spinacia

olerácea L. cultivar BISON de la empresa Rijk Zwaan (Nueva Zelanda) que fueron cultivadas en la Estación Experimental Julio A. Hirschorrn, dependiente de la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales (Universidad Nacional de La Plata), ubicada en la Localidad de Los Hornos, Partido de La Plata (34° 55' LS y 57° 57' LW). Las espinacas fueron cultivadas bajo invernáculo y el agua y nutrientes fueron dosificados mediante riego por goteo (Figuras 1 y 2). Las siembras se realizaron desde el 15 de marzo hasta el 1 de julio a intervalos de 15 días en los años 2007, 2008, 2009, 2010 y 2011. Cuando las plantas se encontraban en condiciones de cosecha, se separaron hojas totalmente expandidas, denominadas de ahora en más "hojas maduras" y hojas de los tres primeros verticilos, denominadas "hojas jóvenes".

Figura 1. Plantas de espinaca a un mes de la siembra creciendo en los invernáculos de la Estación Experimental Julio A. Hirschorrn, Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales (UNLP). Se puede observar el detalle de las cintas de riego por goteo.

MATERIALES Y MÉTODOS |

Figura 2. Plantas de espinaca a dos meses de haber sido sembradas. En este estado se encontraban

listas para ser cosechadas.

Las hojas fueron almacenadas en bolsas de polietileno cerradas para evitar su deshidratación y transportadas inmediatamente al laboratorio para realizar los tratamientos y las determinaciones de diversos parámetros.

Otros experimentos fueron realizados con Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Las semillas de los mutantes insensibles al etileno (ein2-l, ein3-l y ein4) y el mutante de triple respuesta al etileno (ctrl-1) junto con las plantas silvestres (background Columbia) fueron obtenidas del The Arabidopsis Biological Resource Center (Ohio State University - United States). Las semillas fueron sembradas en macetas de 150 cm3 de capacidad conteniendo una mezcla de tierra y vermiculita en partes ¡guales. Las plantas

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crecieron en una cámara a 23 °C con 100 pmoles de fotones m seg por el término de dos meses con un fotoperíodo de 10/14 h luz/oscuridad.

MATERIALES Y MÉTOPÓT|

3.2 Tratamientos

3.2.1 Etefón

Las hojas jóvenes y maduras recién cosechadas fueron puestas en una solución de 200 ppm de ácido cloroetilfosfórico a partir de una solución stock al 48 % (p/v), comercialmente conocido como "Etefón" y 0,1 % v/v de dimetil sulfóxido utilizado como surfactante ("DMSO") por el término de 20 min. Las hojas no tratadas fueron puestas en la misma solución por el mismo término de tiempo, pero sin la adición de etefón. Una vez finalizados los tratamientos, las hojas fueron secadas cuidadosamente con toallas de papel absorbente y puestas en bolsas de polietileno. Las hojas fueron almacenadas en oscuridad a 23 °C. Se tomaron muestras a las 24, 48 y 72 h de realizado el tratamiento.

3.2.2 1-MCP (Smart Fresh™)

Una vez cosechadas, las hojas se colocaron en una cámara de vidrio hermética de 40 L de capacidad, donde fueron tratadas con una concentración de 0,0; 0,1 y 1,0 pL L_1 de 1-MCP (Smart Fresh™). Para llegar a dichas concentraciones de 1-MCP dentro de la cámara, se utilizaron 0, 5 y 50 mg de un complejo de 1-MCP con y-ciclodextrina que en presencia de agua destilada libera el gas (Watkins, 2006). El complejo de 1-MCP con y- ciclodextrina se dispuso en un vaso de precipitado suspendido y una vez sellada la cuba se agregaron 25 mi de agua destilada mediante una jeringa, como se ve en la Figura 3. Las hojas se incubaron por 6 h y luego se guardaron en bolsas de polietileno de baja densidad en oscuridad. Las hojas no tratadas fueron sometidas al mismo tratamiento, pero sin la adición de 1-MCP (Figura 6). Para los tratamientos realizados a 23 °C, las muestras fueron tomadas a los 3 y 6 d (Gergoff et al., 2010b).

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Figura 3. Diagrama de aplicación de 1-MCP sobre hojas de espinaca en cámara hermética.

A su vez, también se realizaron tratamientos con 0,0; 0,1 y 1.0 pL L’1 de 1-MCP y las hojas fueron mantenidas a la oscuridad a 4 °C, tomando las muestras semanalmente por el término de un mes.

3.2.3 Pulsos de luz

De la misma manera que con los tratamientos anteriores, las hojas cosechadas fueron puestas en bolsas de polietileno de baja densidad y fueron llevadas a cámara a 23 °C donde se garantizó la total hermeticidad contra la luz exterior. En este caso se utilizaron solamente hojas maduras. Las hojas fueron sometidas a pulsos de luz a una irradiancia correspondiente al punto de compensación lumínico por tres días con distintas frecuencias y duraciones, que se resumen a continuación:

MATERIALES Y MÉTODOS~|

• Hojas iluminadas en todo el limbo

• Pulsos de 15 min de duración cada 2 h (3 h de fotoperiodo en total). • Pulsos de 15 min de duración cada 6 h (1,5 h de fotoperiodo en total). • Pulsos de 7 min de duración cada 2 h (1,4 h de fotoperiodo en total). • Hojas iluminadas en un hemilimbo

• Pulsos de 15 min de duración cada 6 h (1,5 h de fotoperiodo en total). Las hojas fueron tapadas con papel aluminio respetando la nervadura central como se puede ver en la Figura 4.

Figura 4. Zonas de tratamiento de hojas maduras de espinaca iluminadas en un solo hemilimbo.

Las hojas no tratadas fueron puestas en las mismas condiciones, pero en bolsas oscuras para evitar la filtración de luz. Se utilizaron para los tratamientos tubos fluorescentes de 18 Watts (OSRAM modelo L18 W/765 Basic Daylight 1050 Im). Una vez finalizados los tratamientos con luz, se tomaron las muestras. Las hojas restantes fueron llevadas a cámara oscura a 4 °C y al término de una semana se tomaron muestras.

MATERIALES Y MÉTOPÓT|

De la misma manera se procedió con las hojas iluminadas en un solo hemilimbo. Se utilizó papel de aluminio para evitar la filtración de luz en una de las mitades de las hojas.

3.2.4 Tratamientos a hojas de Arabidopsis thaliana (L.) Heynh

Se cosecharon hojas maduras de plantas de un mes de edad y se las guardó en bolsas de polietileno de baja densidad por el término de 3 d en cámara oscura a 23 °C. Las muestras se tomaron al momento de corte y al finalizar el tratamiento en oscuridad.