MATERIALES Y MÉTODOS 1 Diseño experimental

2.1.1. Procedimiento para la contaminación del suelo

La fracción ≤ 2 mm del horizonte Ap del suelo secado al aire se reempaquetó homogéneamente a una densidad de 1.20 g cm-3 _{en columnas cilíndricas de PVC de 8 cm} de diámetro y 20 cm de longitud. El interior de las paredes de las columnas fue previamente cubierto con una capa fina de vaselina para impedir flujos preferenciales por las paredes de las columnas. La masa de suelo empaquetada (1.3 kg por columna) se calculó en función de la masa requerida para los experimentos posteriores. En primer lugar y mediante el empleo de bombas peristálticas, se añadió agua destilada en la superficie de las columnas a flujo constante (47 ml h-1_{) hasta conseguir el equilibrio entre} los flujos de agua de entrada y salida. A continuación, y una vez establecidas las condiciones de humedad y flujo de agua constantes, utilizando el mismo sistema de irrigación, se añadieron a cada una de las columnas 9.25 L de una solución trielemental de aproximadamente 600 mg L-1 _{de As, Cd, y Tl obtenida a partir de sus} correspondientes sales de calidad analítica KH2AsO4, Cd(NO3)2·4H2O y TlNO3. Los lixiviados de las columnas se recogieron en intervalos regulares de tiempo utilizando un colector de fracciones automatizado. De este modo, la concentración media de los elementos retenidos en las columnas se pudo calcular (29.8, 14.3 y 7 mmol kg-1 _{para el} As, Cd, y Tl, respectivamente) por la diferencia entre la concentración total entrante y saliente de los elementos. Una vez finalizados los experimentos de contaminación, las columnas fueron desmanteladas y el suelo de cada una se secó y se homogeneizó minuciosamente.

2.1.2. Procedimiento de incubación

De las muestras homogeneizadas de suelo, se tomaron aproximadamente 210 g que fueron mezclados uniformemente con muestras sólidas de los subproductos. Se añadió una enmienda con EA y otra con FY+EA por sextuplicado, siguiendo un diseño experimental aleatorio y dejando otras seis muestras sin tratar como control. El tratamiento con EA se aplicó en una proporción del 1% en peso y supuso la adición de 610.5 mg de Ca. Con el fin de añadir la misma cantidad de Ca en el tratamiento conjunto FY+EA, el tratamiento incluyó la adición de 1.32 g de FY y 1.05 g de EA. Todas las

capacidad de campo. El contenido de agua se mantuvo constante durante el periodo de incubación mediante la adición de 60 ml de agua desionizada cada tres días, hasta pasar un volumen de agua de 900 mm, equivalente a un ciclo anual de lluvia en la zona experimental. Los lixiviados de cada una de las columnas se recogieron, se acidificaron (pH≈2) con HNO3 al 65% y se almacenaron a 4 ºC hasta su análisis. La concentración de As total (As, de aquí en adelante), Cd y Tl se determinó por ICP-AES. La concentración de elemento retenido en el suelo tras los experimentos de incubación se calculó por diferencia entre la concentración inicial añadida y la cantidad total de elemento determinada en los lixiviados.

2.1.3. Experimentos de lixiviación

Con el fin de evaluar la movilidad de los elementos después de la aplicación de los tratamientos, la mitad de las columnas incubadas se lavaron, a flujo constante (8 ml h-1_{) mediante el empleo de bombas peristálticas, con 300 ml de una mezcla de ácido} dietilentriaminpentacético (DTPA) 0.005 M, CaCl2 0.01 M y trietanolamina 0.1 M ajustada a pH 7.3 (Lindsay, 1979). La otra mitad de las columnas se lavaron con una solución de ácido acético a pH 4.93, correspondiente a una de las soluciones extractantes utilizadas en el Toxicity Characteristic Leaching Procedure (TCLP) de la EPA (USEPA, 1986). Para asegurar que todo el volumen de la solución añadida (DTPA o TCLP) atravesó la totalidad de la columna de suelo se añadieron 60 ml de agua desionizada a cada columna. Los lixiviados de las columnas se recogieron en intervalos regulares de tiempo, utilizando un colector de fracciones automatizado, se acidificaron (pH≈2) con HNO3 al 65% y se almacenaron a 4 ºC hasta su análisis. La concentración de As, Cd y Tl se determinó por ICP-AES. La concentración de elemento retenido en el suelo tras los experimentos de lixiviación se calculó por diferencia entre la concentración de elemento retenido calculada en los experimentos de incubación anteriores y la cantidad total de elemento determinada en los lixiviados.

2.1.4 Especiación de los elementos en la fase sólida del suelo

Por lo tanto, una vez finalizados los experimentos de lixiviación, las columnas fueron desmanteladas y la muestra de cada una de ellas secada y homogeneizada. De cada una de las columnas se tomaron dos submuestras de 1 g de suelo para realizar el procedimiento de extracción química secuencial de los elementos, con el objeto de identificar los cambios en la especiación de los elementos en la fase sólida del suelo después de la aplicación de las enmiendas. El método de extracción química secuencial

utilizado fue el propuesto por la Community Bureau of Reference (BCR – (Ure et al., 1993)) de la Comisión de la Comunidad Europea, que consta de 3 pasos que caracterizan a las siguientes fracciones: (1) fracción soluble en agua, intercambiable y unida débilmente (FI, paso 1), (2) fracción unida a los oxi-hidróxidos de Al, Fe y Mn (FII, paso 2), y (3) fracción unida a la materia orgánica (FIII, paso 3). En la Tabla VII.1 se presenta un breve resumen de los reactivos empleados, así como de las condiciones de extracción. Además, de cada una de las columnas se tomaron otras 2 muestras de 0.5 g de suelo (<50 m) para la determinación del contenido total (Tot) de los elementos mediante digestión ácida con una mezcla de 8 ml de HNO3 14 M y 3 ml de HCl 12 M (Vercoutere et al., 1995). Todos los extractos fueron filtrados a vacío con filtros de nitrato de celulosa (0.45 µm), acidificados (pH≈2) con HNO3 al 65% y almacenados en tubos de polipropileno a 4 ºC para su correcta conservación hasta la determinación de la concentración de As, Cd y Tl por ICP-AES.

En todas las determinaciones mediante ICP-AES, se llevaron a cabo ajustes de calibración cada 20 muestras, incluyendo blancos y controles de calibración intermedios. Las soluciones de calibración abarcaban el rango de concentración de las muestras y se prepararon en la misma matriz que los agentes extractantes usando soluciones certificadas.

Tabla VII.2. Esquema del procedimiento de extracción secuencial empleado (BCR) para la especiación de los elementos

Fases del suelo Extractante Tiempo de agitación y

temperatura

FI Soluble en agua, intercambiable y unida débilmente

40 ml de CH3COOH 0.11 M 16 h a temperatura ambiente

FII Oxi-hidróxidos de Al, Fe y Mn

40 ml de HONH2·HCl 0.5 M (pH 2) 16 h a temperatura ambiente

FIII Materia orgánica 10 ml de H2O2 8.8 M (pH 2) 10 ml de H2O2 8.8 M (pH 2)

1 h a temperatura ambiente y 1 h a 85 ºC

Los blancos se utilizaron para corregir cualquier ruido de fondo, mientras que las soluciones estándar de los elementos se emplearon para evaluar la precisión instrumental. La concentración de los elementos en las soluciones desconocidas se calculó a través de una curva de calibración externa. Los límites de detección se calcularon como tres veces la desviación estándar de la señal instrumental de los blancos, a partir de la repetición de 10 análisis de las soluciones de los blancos y mostraron que se pueden medir concentraciones del orden de pocos µg L-1 _{para los tres} elementos.

2.2. Análisis estadístico

Para estudiar la significancia estadística de las diferencias encontradas en todos los experimentos como resultado de los tratamientos, se realizó un análisis de la varianza (ANOVA) de 2 vías (tratamiento, elemento). En función de la homogeneidad de la varianza, se utilizaron pruebas post-hoc de Bonferroni o de Tamhane para establecer las diferencias estadísticas entre los pares resultantes de la combinación del tratamiento y el elemento. Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando el programa estadístico SPSS v. 15.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL).

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN