Mecanismo de activación y de regulación de la calpaína 4,5,11,

Habitualmente la calpaína se encuentra en el citosol como una enzima inactiva, que se desplaza hacia la membrana en respuesta a un incremento de los niveles de Ca2+ celulares. En la membrana, la calpaína se activa en presencia de Ca2+ y fosfolípidos. Durante la activación se produce la hidrólisis autocatalítica del dominio I y como consecuencia, las subunidades de 80 y 30 KDa23 se disocian. Una vez que la calpaína está en la forma activada hidroliza los sustratos proteicos en la membrana, o bien en el citosol, después de abandonar la membrana.

En ausencia de Ca2+, los subdominios que constituyen el dominio catalítico IIa y IIb, se encuentran separados debidos a restricciones conformacionales impuestas por los aminoácidos que conforman la proteína. La presencia de Ca2+ induce cambios estructurales y facilita la formación de un sitio catalítico y funcional.24,25 Recientes

estructuras de Rayos X han revelado que la unión al Ca2+ provoca un mecanismo de

activación a nivel molecular.24 Para la m-calpaína se pueden encontrar al menos tres sitios de unión al Ca2+ diferentes: a los dominios tipo calmodulina (IV y VI), a un bucle ácido presente en el dominio III y al dominio proteolítico (dominio II).

unión de los dedos de cinc. Mckee, T.; Mckee, J.R. Bioquímica, McGraw Hill Interamericana, 2003, 3ª Ed,133-134.

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24

Moldoveanu, T; Hosfield, C. M.; Lim, D; Elce, J. S.; Jia, Z; Davies, P. L. Cell2002, 108, 649-660.

25

El mecanismo propuesto para la regulación de la actividad de la m-calpaína comprende dos etapas.24,25 La primera es la liberación de las restricciones conformacionales impuestas por las interacciones de los dominios. La unión del Ca2+ a los dominios IV, VI y III, rompe la unión del dominio I con VI y del dominio II con III lo que conlleva una disociación de la subunidad de 30 de la de 80 KDa. La segunda etapa consiste en una reorganización del sitio activo en el dominio II como consecuencia de la unión de dos átomos de Ca2+ al mismo (uno al subdominio IIa y otro al IIb).

Este mecanismo de activación en dos etapas se considera un mecanismo general de activación aplicable a las calpaínas que no interaccionan con la subunidad de 30 KDa o a las calpaínas atípicas, debido a que en todos los casos el dominio proteolítico está siempre constituido por los subdominio IIa y IIb y los residuos que interaccionan con las dos unidades de Ca2+ en IIa y IIb se conservan en todas las calpaínas. En el caso de las calpaínas no asociadas con subunidad pequeña de 30 KDa o en aquellas que carecen de dominios III o IV, la primera etapa de activación puede ser obviada y se activan mediante la segunda etapa.

Figura 2.4. Activación de la calpaína.

En la Figura 2.4 se encuentra representado un esquema del mecanismo de activación de la calpaína. En éste, tras la activación de la calpaína por Ca2+ y fosfolípidos, se produce un acercamiento de los dos subdominios IIa y IIb, produciéndose la disociación de la subunidad de 30 KDa de la de 80 KDa.

24

Moldoveanu, T; Hosfield, C. M.; Lim, D; Elce, J. S.; Jia, Z; Davies, P. L. Cell2002, 108, 649-660.

25

La actividad de la calpaína está regulada principalmente por la presencia de Ca2+, tanto temporal como espacialmente, pero se ha visto que la fosforilación de la calpaína puede ser otro mecanismo importante para la regulación de su actividad. Así, Glading y col.26,27 han demostrado que factores del crecimiento tales como Epidermal

growth factor (EGF) son capaces de activar a la calpaína 2 mediante la fosforilación

mediada por la kinasa Extracelular signal-regulated kinase (ERN) tanto in vivo como in

vitro y que esa activación puede ocurrir incluso en ausencia de un flujo de calcio en el

citosol. Por otro lado la fosforilación de la calpaína en Ser-369 del dominio III por la proteína kinasa A, restringe el movimiento del dominio y „congela‟ a la calpaína en su

estado inactivo.28

La unión de calpaína a moléculas tanto exógenas como endógenas, de estructura proteica o no, puede regular también su actividad proteolítica. Así, isovalerocarnitina (IVC), un producto que proviene del metabolismo de L-leucina, es un potente activador de calpaína 2. La activación por parte de IVC tiene un efecto doble: por un lado incrementa la afinidad de calpaína por Ca2+ y por otro incrementa la vmax respecto a los valores observados,29,30 trabajando la enzima en una disolución saturada de Ca2+.

La proteína acil-co A-protein (Acyl-CoA protein) es un homodímero que ejerce multidud de funciones. También es un potente activador de calpaínas, disminuyendo la concentración de Ca2+ requerida para la activación de la m-calpaína.31

La calpastatina, el inhibidor endógeno natural de la calpaína, también está implicada en su regulación. Los cuatro dominios inhibidores de la calpastatina pueden inhibir cuatro moléculas de calpaína al mismo tiempo. Por otra parte la modulación del balance de los niveles de calpaína relacionados con la calpastatina puede también regular su actividad. La degradación de la calpastatina mediada por la calpaína está relacionada con la activación de la misma in vivo.32,33

26

Glading, A; Lauffenburger, D. A.; Wells, A. Trends Cell Biol. 2002, 12, 46-54.

27

Glading, A.; Bodnar, R. J.; Reynolds, I. J.; Shiraha, H.; Satish, L.; Potter, D. A.; Blair, H. C.; Wells, A. Mol. Cell. Biol. 2004, 24, 2499-2512.

28 _{Shiraha, H; Glading, A; Chou, J; Jia, Z; Wells, A. Mol. Cell. Biol. 2002, 22, 2716-2727.}

29 _{Pontremoli, S.; Melloni, E.; Michetti, M.; Sparatore, B.; Salamino, F.; Siliprandi, N.; Horecker, B. L. Biochem.}

Biophys. Res. Commun. 1987, 148, 1189-1195.

30

Pontremoli, S.; Melloni, E.; Viotti, P. L.; Michetti, M.; Di Lisa, F.; Siliprandi, N. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990, 167, 373-380.

31

Melloni, E; Averna, M; Salamino, F; Sparatore, B; Minafra, R; Pontremoli, S. J.Biol. Chem. 2000, 275, 82-86.

En la Figura 2.5 se muestra el mecanismo de regulación de la calpaína que se ha detallado anteriormente en este apartado.

Figura 2.5. Mecanismo de regulación de la calpaína (tomado de la ref.5).