Con el fin de obtener el registro ante la EPA, en el acta FIFRA se encuentran las guías para la evaluación de los desinfectantes (considerados como pesticidas), las cuales establecen que se deben realizar pruebas de efectividad del desinfectante mediante métodos utilizados por la Asociación Oficial de Químicos Analíticos (AOAC) para poder obtener el registro. Las pruebas que se reportan son: Pruebas soporte (Carrier test), y de dilución de uso (Use-Dilution) para evidenciar la actividad bactericida, micobactericida, y esporocida; estas pruebas se conocen como “Pruebas de efectividad de los desinfectantes” o DET's por sus siglas en ingles (Martínez, 2006).
En resumen si se utiliza un desinfectante que este registrado con EPA, este ya se encuentra evaluado. La concentración recomendada, espectro de acción, condiciones y tiempo de exposición ya han sido establecidos.
Cuando el desinfectante es preparado in situ es necesaria una calificación la cual es equivalente a las pruebas realizadas para el registro ante la EPA.
Recientemente en el año 2007, la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) expidió la sección <1072> “Antisépticos y Desinfectantes” en la cual se detalla la metodología que puede desarrollarse para realizar la evaluación de la efectividad de los desinfectantes; las pruebas que la farmacopea sugiere son el coeficiente fenólico
(pruebas en suspensión) y la dilución de uso (pruebas carrier), las cuales están incluidas dentro de los DET’s (Martínez, 2006).
Sin embargo, estas no son las únicas pruebas que se deben realizar a los desinfectantes. Los DET’s no representan las condiciones de uso real, además existen grandes dificultades para DET’s en cuanto a su repetibilidad y a su reproducibilidad de resultados (Reyboruck, 1998). En estas no se toma en cuenta el proceso de limpieza completo; es por esto que la toma de muestras después de un proceso de limpieza y desinfección in vivo asegura tanto la efectividad real del desinfectante como del mismo proceso de limpieza (Martínez, 2006).
Los DET’s se dividen en tres: pruebas en suspensión, pruebas soporte “Carrier” y desinfección de superficies. Para brindar seguridad en cuanto a la eficacia de un desinfectante es conveniente realizarle los 3 tipos de estudios (Reyboruck, 1998).
2.7.1 Pruebas en suspensión
Existen diferentes tipos de pruebas en suspensión: Las pruebas en suspensión cualitativas, el método del coeficiente fenólico y las pruebas en suspensión cuantitativas. Todas tienen en común el siguiente procedimiento: un volumen apropiado de suspensión bacteriana es adicionado a una concentración determinada de una solución de desinfectante. Después de un tiempo prudente de exposición la muestra es examinada para evidenciar si la suspensión bacteriana fue inhibida o no. Los resultados cualitativos se dan como crecimiento o no crecimiento.
Mientras que para las pruebas en suspensión cuantitativas se procede a realizar recuentos para identificar el efecto microbiocida (Microbiocidal Effect, ME), para que un desinfectante apruebe un test de suspensión cuantitativa de haber inhibido por lo menos al 99.999% de los microorganismos lo que equivale a la reducción de 5 unidades logarítmicas (Reybrouck, 1998).
2.7.1.1 Dilución en tubo
Se realizan diferentes soluciones del desinfectante. El mismo volumen de cada dilución se adiciona en tubos estériles, a cada tubo se le añade la misma cantidad de una suspensión del microorganismo utilizado como prueba. A determinados intervalos de tiempo se transfiere un alícuota de cada tubo a otro que contenga medio de cultivo. Estos tubos inoculados se incuban a la temperatura y crecimiento óptimo de crecimiento según el microorganismo. Al cabo de este tiempo se examina el crecimiento del microorganismo mediante la aparición o ausencia de turbidez en el tubo (crecimiento positivo o negativo). Aquellos tubos que presentan crecimiento negativo indican la dilución a la cual ese agente químico inhibe al microorganismo prueba. El control de la prueba se realiza con agua estéril siguiendo el mismo procedimiento (Rojas, 2001).
Una complementación de esta técnica es el aislamiento e identificación de una muestra representativa de los tubos positivos con el fin de confirmar que el crecimiento pertenece al microorganismo estudiado y descartar una posible contaminación que altere los resultados promoviendo la aparición de resultados falsos negativos respecto a la presencia de turbidez (Reybrouck, 1998)
Por otra parte también es importante tener en cuenta las propiedades del o de los desinfectantes en el momento de realizar la transferencia al tubo con medio de cultivo ya que la acción bactericida de algunos desinfectantes puede continuar aun después de haber realizado la transferencia al tubo a incubar lo que prolongaría el tiempo de exposición; si el desinfectante se inactiva por dilución (como el alcohol ) el procedimiento y los resultados pueden ser confiables, pero si por el contrario no se inactiva por dilución (que es lo que se realiza al momento de la transferencia), se debe realizar una pre-transferencia a un medio neutralizante (MN) los cuales tienen compuestos que inactivan la acción bactericida del o los desinfectantes permitiendo
de esta forma obtener resultados reales de la prueba evitando los resultados falsos negativos (Sutton, et al, 2002).
2.7.1.2 Sensibilidad antimicrobiana (Kirby-Bauer)
La sensibilidad antimicrobiana también se puede evaluar de forma semi-cuantitativa observando los halos de inhibición de un agente antimicrobiano bien sea antibiótico o desinfectante. La técnica consiste en preparar una suspensión con una concentración conocida de microorganismo del orden de 108-7ufc/mL. La suspensión es inoculada y
sembrada masivamente en una placa de agar Mueller Hinton, el cual permite una mayor difusión del agente antimicrobiano; para que el medio permita la difusión de debe cumplir con ciertas características: profundidad de medio de 4 a 5 mm y el pH debe ser de 7.4 +/-0.2. A su vez depende de ciertos factores como la concentración de microorganismo sembrado y la concentración de cationes divalentes que hay en el medio (Murray, et al. 1983). Discos de papel filtro son sumergidos en una concentración determinada del desinfectante y colocados sobre la placa de agar con el microorganismo, el control de la técnica son discos impregnados con agua estéril. La lectura se realiza según el tiempo de incubación de los microorganismos. Se deben observar halos que indican la inhibición del crecimiento, estos deben ser medidos; a mayor diámetro de halo mayor es la efectividad del desinfectante (Olson, 2007).
2.7.1.3 Coeficiente Fenólico
Es la técnica más conocida para la evaluación de los desinfectantes en suspensión, esta validada por la AOAC (Phenol Coefficient Method 955.11); en esta se compara la acción bactericida de un determinado desinfectante frente a la del Fenol; se prepara una suspensión conocida del microorganismo, concentraciones de los desinfectante de prueba en tubos (dilución recomendada, una mayor y una menor a esta con un volumen final de 5mL). De igual forma se preparan tres concentraciones de fenol según el microorganismo de estudio generalmente 1/100, 1/90,1/80. Una vez
preparado el material se adicionan 0.5 mL o una asada de la suspensión a los tubos con la dilución. El estudio evalúa tres tiempos de exposición (5, 10 y 15 minutos) por cada dilución tanto de desinfectante prueba como de dilución de fenol, cada vez que pase un tiempo de exposición se transfieren 0.5 mL o una asada (4 mm) del tubo la dilución y microorganismo a un caldo nutritivo y este se deja incubar según el tipo de microorganismo en estudio. Los resultados son expresados cualitativamente (crecimiento o inhibición del crecimiento) a cada uno de los tiempos de exposición, teniendo en cuenta la dilución del desinfectante y fenol que no inhiba a los microorganismos a los cinco pero si a los diez y quince minutos con respecto a cada uno de los microorganismos, para obtener el numero del coeficiente fenólico, el cual expresa cuantas veces es mejor el desinfectante de prueba que el fenol, se aplica la ecuación # 1; si el número es menor a 1 no se recomienda la utilización del desinfectante por lo menos a esa concentración. (AOAC, 2005)
.
Ecuación 1. Número del Coeficiente fenólico 2.7.2 Pruebas Carrier
2.7.2.1 Método de la Dilución de Uso
Este método validado por la AOAC (Use-Dilution Method 955.15) se utiliza para verificar la acción de un desinfectante frente a un microorganismo el cual esta adherido a una superficie inerte. El método consiste en contaminar el soporte - carrier (material característico de la industria como: acero inoxidable, polietileno, PVC, etc.) sumergiéndolos con una suspensión del microorganismo en una concentración conocida por 30 minutos; después del tiempo de exposición, el soporte es extraído de la suspensión y se deja secar a temperatura ambiente. Luego, el soporte es sumergido en una dilución conocida de desinfectante por 10 minutos (tiempo estandarizado) y finalizado el tiempo de exposición el soporte es extraído y
depositado en un Medio Neutralizante por 30 minutos para finalmente ser adicionado a un caldo de crecimiento. La lectura se realiza de forma cualitativa observando la turbidez de tubo, esta prueba se debe realizar simultáneamente con mínimo 10 soportes para mayor confiabilidad. Una modificación a esta técnica que esta validada por la AOAC es la adición de materia orgánica como interferente, con el fin de evidenciar inactivación de la acción bactericida del desinfectante. Con el objetivo de confirmar la inactivación del desinfectante frente al microorganismo prueba sobre la superficie la prueba se acompaña de controles de: viabilidad del microorganismo, pureza de la materia orgánica (si es el caso) y un procedimiento paralelo en el que se reemplaza el desinfectante por agua destilada estéril (AOAC, 2006).
2.7.3 Pruebas en superficie – In Vivo
Este tipo de prueba se maneja en condiciones reales, tiene como objetivo verificar la dilución de uso del desinfectante bajo condiciones reales en la industria. La prueba consiste en contaminar la superficie (segmento de acero inoxidable) con un inóculo del microorganismo (concentración conocida), después del tiempo de exposición al desinfectante se de determina el numero de microorganismos sobrevivientes por contacto directo con agar nutritivo (caja de petri) o por la técnica de lavado, en la cual la parte es lavada con un diluyente y el número de bacterias es determinado en solución residual. La técnica puede ser reemplazada directamente por la toma de muestras del proceso de limpieza realizado en la industria (Reybrouck, 1998).
2.8 Limpieza
Se entiende por limpieza como el proceso de empleo correcto de productos químicos (antimicrobianos) en una secuencia dada para disminuir la suciedad y los agentes