3.2.10.
An´alisis mediante western-blotting
Tras la separaci´on de las muestras proteicas por electroforesis en geles des- naturalizantes de poliacrilamida, las prote´ınas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Protran 0.2µm, Schleider&Schuell) por electrotransferencia del ti- po semidry o en l´ıquido.
La mayor parte de las detecciones de prote´ınas eluidas en las cromatograf´ıas (ver apartado 3.2.7 en p´ag. 83) se realizaron por transferencia semidry. En este caso, la membrana, los papeles de blotting (gel blotting papers, Schlei- cher&Schuell) y el gel se sumergieron brevemente en el tamp´on de transferencia (39 mM glicina, 48 mM Tris pH 8.8, 20 % metanol, 0.037 % SDS) previamente a su colocaci´on en el aparato de transferencia (Trans Blot SD semidry Trans- fer Cell de Bio-Rad). Las condiciones de transferencia fueron de 3 mA/cm2 de membrana y un voltaje m´aximo de 25 V.
La transferencia en l´ıquido se llev´o a cabo mediante un m´etodo basado en el trabajo de Thiriet y Albert, 1995 [210]. El tamp´on de transferencia que se us´o fue tamp´on de electroforesis (ver p´ag. 90) con un contenido del 20 % (v/v) en meta- nol. La transferencia se efectu´o con un voltaje de 100 V durante 10 min y 60 V durante 20 min, y fue comprobada mediante tinci´on con 1 % (p/v) Ponceau S en 1 % (v/v) ´acido ac´etico durante 1 min. A continuaci´on el exceso de colorante fue eliminado mediante varios lavados con 1 % de ´acido ac´etico. La membrana fue escaneada y su imagen se guard´o en formato electr´onico para la comparaci´on de la cantidad de prote´ına por carrera con la se˜nal obtenida por quimioluminiscen- cia. Tras la tinci´on, la membrana fue lavada con agua destilada o PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4) para que el
pH de la membrana no permaneciera acidificado.
Cuando la prote´ına que se deseaba identificar conten´ıa ep´ıtopos HA, la mem- brana fue incubada 1 h a temperatura ambiente en PBS que conten´ıa 1 % de leche desnatada en polvo (disoluci´on de bloqueo). La membrana fue incubada toda la noche a 4◦
C, con una concentraci´on del anticuerpo monoclonal de rat´on α-HA 12CA5 (Roche) de 133 ng/mL en soluci´on de bloqueo. Tras la incubaci´on con el
anticuerpo primario la membrana es sometida a dos lavados r´apidos con PBS-T 0.5 % (PBS con 0.5 % de Tween-20) a temperatura ambiente, y a continuaci´on se lav´o durante 10 min 3 veces con el mismo tamp´on. Se llev´o a cabo un ´ultimo lavado con PBS durante 10 min para eliminar el Tween-20. La incubaci´on con el anticuerpo de ovejaα-rat´on etiquetado con peroxidasa (Amersham Biosciences) y diluido 1/5000 en PBS 1 % de leche, se realiz´o durante 1 h 30 min. Tras la incubaci´on con el anticuerpo secundario, la membrana se lav´o con PBS-T 0.5 % del mismo modo que anteriormente. La detecci´on de las prote´ınas por quimio- luminiscencia se llev´o a cabo con el sistema ECL Western Blotting (Amersham Biosciences) seg´un las instrucciones del fabricante.
Las prote´ınas etiquetadas con ep´ıtopos c-MYC fueron detectadas de manera muy similar a las etiquetadas con HA, pero con las diferencias que se detallan a continuaci´on. El bloqueo se realiz´o durante 1 h a temperatura ambiente en PBS-T 0.1 % con 2.5 % de leche, y 1 h a 4◦C. La membrana se incub´o toda la
noche a 4◦
C en una disoluci´on con 1.33 ng/mL de anticuerpo monoclonal α- c-MYC 9E10 (Roche) en disoluci´on de bloqueo. Los lavados se efectuaron del mismo modo, pero a 4◦C, con PBS-T 0.1 % y sin el lavado final sin Tween-20.
La incubaci´on con anticuerpo secundario tambi´en fue id´entica excepto porque fue a 4◦C y el anticuerpo estaba diluido en PBS-T 0.1 %. El resto del protocolo
se desarroll´o en las mismas condiciones.
Las membranas con muestras procedentes del proceso de extracci´on de TAP se incubaron al menos 1 h a temperatura ambiente en PBS que conten´ıa 5 % (p/v) de leche desnatada en polvo y 0.1 % (v/v) de Tween-20 (disoluci´on de bloqueo). A continuaci´on se incub´o 1 h 30 min en una diluci´on 1/2000 en disoluci´on de bloqueo del anticuerpo policlonal de conejoα-PAP, el cual reconoce la prote´ına A. A continuaci´on se realizaron dos lavados de 5 min y cuatro de 10 min con PBS 0.1 % Tween-20. Por ´ultimo se realiz´o un lavado con PBS de 10 min y se emple´o el sistema ECL Western Blotting (Amersham Biosciences) para la detecci´on de las prote´ınas con fusi´on TAP.
Por otro lado, las membranas con muestras del proceso de purificaci´on por TAP se incubaron un m´ınimo de 1 h a temperatura ambiente en una disoluci´on al
3.2.10 An ´alisis mediante western-blotting 93
2 % (p/v) de agente bloqueante del kit ECL Advanced Western Blotting (Amers- ham Biosciences) en TBS (20 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl) 0.1 % (v/v) Tween-20. A continuaci´on la membrana se incub´o durante toda la noche a 4◦C
en una diluci´on 1/20000 de anticuerpo policlonal de conejoα-TAP en disoluci´on de bloqueo. Este anticuerpo, a diferencia del α-PAP, es capaz de reconocer el p´eptido de uni´on a calmodulina (CBP), y por tanto la prote´ına de fusi´on tras su corte con la proteasa TEV. Al d´ıa siguiente se realizaron dos lavados r´apidos, uno de 15 min y por ´ultimo tres de 5 min con TBS Tween-20 0.1 % (p/v) a 4◦C.
A continuaci´on se incub´o la membrana durante 1 h con una diluci´on 1/30000 de anticuerpoα-conejo conjugado con la peroxidasa del r´abano picante (Amers- ham Biosciences) en TBS 2 % (p/v) de agente bloqueante 0.1 % (p/v) Tween-20. Se repitieron la serie de lavados y la detecci´on se realiz´o con los reactivos del sistema ECL Advanced Western Blotting (Amersham Biosciences).
Stripping o lavado de membranas
Para incubar una membrana con dos anticuerpos distintos sucesivamente, ´esta se lav´o dos veces con agua destilada y se incub´o 1 h a 37◦C con agitaci´on
en tamp´on de Stripping (5 % (v/v) ´acido ac´etico, 0.5 M NaCl, 4 M urea, 2 % 2-mercaptoetanol). Tras esto se lav´o cuatro veces durante 5 min con agua des- tilada, y dos veces con PBS-T 0.01 % o TBS-T 0.01 % tambi´en durante 5 min cada lavado. Finalmente se bloque´o de nuevo la membrana y se prosigui´o como normalmente.