Medidas de Bioseguridad

Para evitar una contaminación cruzada, en el transcurso de los bioensayos, cada uno de los acuarios contó individualmente con su propio material y equipo (redes, cubetas, línea de aire, y piedras aireadoras). El equipo de uso común, cada vez que se utilizó fue enjuagado con una solución de cloro al 2%. Otra medida de prevención fue separar físicamente los controles negativos de los acuarios con las réplicas de cada bioensayo (Hasson et al., 1995). Además, cada uno de los acuarios contó con una tapa de acrílico, para evitar infecciones cruzadas por aerosoles.

Las medidas sanitarias incluyeron un adecuado lavado y desinfección de todo el material al iniciar y finalizar cada experimento. Para la desinfección se utilizó hipoclorito de sodio al 0.05%. Por último, el agua producto de los recambios, fue desinfectada por hipercloración por 24 horas (Lotz, 1997) antes de ser eliminada.

Se evitó el tránsito a la sala de bioensayos a personas ajenas al estudio. Así como también, se usó dentro de la sala un tapete sanitario con una solución permanente de cloro al 2%. Finalmente, los organismos muertos durante la etapa de investigación y que no fueron necesarios para el procesamiento histológico fueron incinerados.

5.3. Infección Experimental.

Por las características propias del trabajo de investigación, éste se dividió en dos etapas: Infección experimental y procesamiento de imágenes. En la primera, se llevó a cabo la obtención de material infectado con WSSV, en el cual por medio de histología se pudieron observar los cuerpos de inclusión del virus de mancha blanca. La obtención de este material se realizó de dos maneras; llevando a cabo una infección experimental y por otro lado haciendo uso del material que se cuenta en el acervo histopatológico del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C. Unidad Mazatlán.

5.3.1. Colecta de Organismos.

Se trasladaron juveniles sanos de camarón blanco (Litopenaeus vannamei) con un peso de 1 ± 0.27 gramos, procedentes de una granja y se trasladaron a la Unidad Mazatlán en Acuacultura y Manejo Ambiental, CIAD, A.C. Previa a la colecta, se tomó una muestra de 25 camarones de un estanque seleccionado, para verificar por la técnica PCR que estuvieran libres de WSSV, utilizando el kit IQ2000 (Farming Intelligene Tech. Corp, USA).

El lote de aproximadamente 300 organismos fue transportado a la sala de acuarios de esta unidad de investigación, en bolsas de plástico con oxígeno y depositadas en cajas de poliuretano y mantenidas a una temperatura entre 20-23°C. Los organismos fueron aclimatados durante cinco días en dos tanques de plástico de 450 L (RotoplasMR, México) mantenidos con aireación constante y alimentados ad libitum con alimento peletizado Camaronina (PurinaMR, México) con un contenido de proteína del 30%. El alimento fue suministrado diariamente y distribuido en dos tiempos; a las 9:00 y a las 17:00 horas.

5.3.2. Preparación del Inóculo.

Durante la realización de los bioensayos de infección experimental, se llevaron a cabo dos tipos de infecciones: Inyección intramuscular y Per os.

Los organismos utilizados para la preparación del inóculo, se obtuvieron durante el mes de Septiembre del año 2001 de un brote de WSSV de una granja acuícola de la región, donde se cultiva camarón y que a la fecha de la realización de los experimentos, se había mantenido en congelación a –20°C (congelador Kelvinator, USA). Para confirmar que el tejido utilizado en la preparación del inóculo era positivo para WSSV, se corrió una reacción de PCR utilizando el kit comercial IQ2000.

Para los bioensayos de infección vía inyección intramuscular, se prepararon 2 tipos de inóculo. Para la obtención del primer inóculo, se hicieron algunas modificaciones a los trabajos de infección realizados por Hasson et al. (1995) y Overstreet et al. (1997). Se preparó un homogenizado que contenía el material infectado con WSSV en una proporción de 1:10 (w/v) de tejido y buffer TN (23.37 g de Cloruro de Sodio y 2.42 g de Tris base en 1 lt de agua destilada). Se utilizó un robot de cocina ( Moulinex ®, USA) para macerar 14.14 g de tejido en 30 ml de buffer TN para facilitar la homogenización. Con el resto del buffer se enjuagó el equipo y el homogenizado fue depositado en tubos de plástico graduados de 10 ml (Corning®, USA). Los tubos fueron centrifugados durante 3 minutos a 3000 rpm y a 4°C en una centrífuga (Beckman, modelo GS- 15R, USA) utilizando un rotor F1010. El producto sobrenadante de esta centrifugación fue transferido a tubos limpios y nuevamente se centrifugó a 3000 rpm durante 3 minutos a 4°C. El sobrenadante obtenido, se transfirió a tubos limpios y se centrifugaron por 3 minutos a 1200 rpm. Posteriormente este sobrenadante fue pasado a través de filtros de membrana estériles de 0.8 μm

de poro (Acrodisc, Gelman Sciences, USA). Finalmente, con el producto de esta filtración se prepararon alícuotas, las cuales fueron colocadas en tubos estériles de 1.5 ml y se mantuvieron en congelación a –20°C para su posterior utilización.

En el segundo inóculo, la fuente de tejido infectado con WSSV fue obtenida de organismos positivos del Laboratorio de Servicios de esta Unidad, fechados en el mes de Septiembre del año 2002 y que a la fecha se encontraba en congelación a -20°C. El tejido fue homogenizado con buffer TN en una proporción de 1:5 (w/v). Para llevar a cabo el proceso de maceración del tejido, se utilizó una licuadora (Hamilton Beach ®, modelo 58200, USA). Se colocaron 50 g de tejido infectado con WSSV en 50 ml de buffer TN para facilitar la homogenización, los 50 ml de buffer restantes se utilizaron para enjuagar el equipo. El homogenizado fue depositado en tubos de plástico graduados de 10 ml (Corning®, USA) y centrifugados a 4°C durante 9 minutos a 10,000 rpm en una centrífuga (Beckman GS-15R, USA) utilizando un rotor F1010. El sobrenadante producto de esta centrifugación fue transferido a tubos limpios y nuevamente se centrifugó a 10,000 rpm durante 9 minutos a 4°C. Se tomó nuevamente el sobrenadante y con él se prepararon alícuotas, las cuales fueron colocadas en tubos eppendorf estériles de 1.5 ml y se mantuvieron en congelación a –20°C para su posterior utilización.