MEDIOS DE AISLAMIENTO ENRIQUECIDOS Y DIFERENCIALES • AGAR MACCONKEY SORBITOL

Medio selectivo y diferencial empleado para el aislamiento de Escherichia coli O157:H7 Los componentes son similares a los utilizados para el Agar MacConkey pero la lactosa ha sido reemplazada por el sorbitol. E. coli O157:H7 no fermenta sorbitol dando colonias transparentes mientras que la mayoría de E. coli fermenta dando colonias rosadas.

Composición Peptona 20 g Sorbitol 10 g Sales biliares Nº3 1,5g Cloruro de sodio 5 g Rojo neutro 0,03 g Cristal violeta 0,001 g AD 1000 ml Agar 15g pH final a 25 ºC 7,1 ± 0,2 Preparación

Suspender 51,5 g del polvo en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos. Llevar a ebullición hasta disolución total. Esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos.

Interpretación

Microorganismo Crecimiento Colonias

Escherichia coli O157:H7 bueno transparentes

• AGAR TRIPTICASA DE SOJA (TSA)

Medio utilizado para fines generales para el cultivo de microorganismos fastidiosos y no fastidiosos.

Composición

Preparación

- Disolver 40 g del polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullición hasta disolución completa.

- Dispensar el medio de acuerdo al uso. Esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos. • MEDIO CROMOGÉNICO CHROMAgar O157

Preparación

1) Disolver 7,3 g del polvo comercial (un envase) en 250 ml de agua destilada estéril fría. 2) Calentar a ebullición hasta disolución completa.

3) Homogenizar el medio.

4) Transferir los frascos a un baño de agua a 50 ºC.

5) Dispensar aproximadamente 20 ml del medio por cada placa, evitando la formación de burbujas.

6) Conservar a 4 ºC, protegidos de la luz, preferentemente envueltos en papel metalizado. 7) Secar el agar en un área estéril antes de usar.

• MEDIO CROMOGÉNICO. AGAR O157:H7 ID (BioMérieux) Fundamento

La característica diferencial de los medios cromogénicos se basa en la detección de la actividad de dos enzimas:

3) β D galactosidasa presente en todas las cepas de E. coli sea cual sea su serotipo 4) β D glucuronidasa específica de todas las cepas de E. coli que no sean O157:H7 Preparación

1) Aflojar el tapón del frasco de agar.

2) Fundir el agar a baño maría hirviente entre 45 minutos y 1 hora, no superar 1 hora de regeneración.

3) Homogeneizar después del cierre del tapón. 4) Transferir los frascos a un baño de agua a 50 ºC.

5) Dispensar aproximadamente 20 ml del medio por cada placa, evitando la formación de burbujas. Triptona 15 g Soitona 5 g Cloruro de sodio 5 g Agar 15 g AD 1000 ml pH final a 25 ºC 7,3 ± 0,2

6) Conservar a 4 ºC, protegidos de la luz, preferentemente envueltos en papel metalizado. 7) Secar el agar en un área estéril antes de usar.

8) Sembrar 50 µl del caldo de enriquecimiento, 50 µl de perlas inmunomagnéticas, o una ansada de una colonia sospechosa, sobre la superficie del medio de manera que se puedan obtener colonias individuales bien aisladas.

9) Incubar a 37 ºC durante 18-24 h. 10) Lectura

• MEDIO FLUOROGÉNICO. FLUOROCULT E. coli O157:H7-AGAR (Merck) Fundamento

Los medios fluorogénicos se basan en la utilización de sustratos específicos para seleccionar y diferenciar las cepas de E. coli O157:H7/NM de otros microorganismos.

1) Disolver 55 g del polvo comercial en 1000 ml de agua desmineralizada. 2) Autoclavar a 121 ºC durante 15 minutos.

3) Homogenizar el medio.

4) Transferir a un baño de agua a 50 ºC.

5) Dispensar aproximadamente 20 ml del medio por cada placa, evitando la formación de burbujas.

6) Conservar a 4 ºC, protegidos de la luz, preferentemente envueltos en papel metalizado. 7) Secar el agar en un área estéril antes de usar.

8) Sembrar 50 µl del caldo de enriquecimiento, 50 µl de perlas inmunomagnéticas, o una ansada de una colonia sospechosa, sobre la superficie del medio de manera que se puedan obtener colonias individuales bien aisladas.

9) Incubar a 37 ºC durante 18-24 h. 10) Lectura

• AGAR MÜELLER HINTON (MH) Composición Infusión de carne 300 g Casaminoácidos 17,5 g Almidón 1,5 g Agar 17 g AD 1000 ml pH final a 25 ºC 7,2 ± 0,2 Preparación:

1. Resuspender 38 g del polvo en un litro de agua destilada. 2. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. 3. Dejar enfriar hasta una temperatura de 50ºC

4. Dispensar 25 ml del medio por cada placa para obtener una capa de 4 mm de espesor. 5. Conservar a 4ºC. Las placas así conservadas pueden utilizarse hasta 4 días después de su

preparación.

• AGAR BASE TRIPTOSA CON GLOBULOS ROJOS LAVADOS (AGRL) Y SIN LAVAR (AGRSL)

Estos medios se utilizan para la detección de la enterohemolisina de EHEC. Se emplean placas con agar base triptosa suplementado con 10 mM de cloruro de calcio y 5% de sangre desfibrinada de cabra u oveja, previamente lavada tres veces con solución salina buferada esteril pH 7,2. (AGRL) y como control se emplean placas de agar con 5% de sangre desfibrinada de oveja, sin lavar y sin el agregado de cloruro de calcio. (AGRSL)

Placa de AGRL Composición

Para 20 ml de agar (una placa)

Recomendación Se debe emplear sangre fresca, de no más de 10 días de extraída. Preparación de la placa AGRL

1. Dispensar el medio de TSA en cada placa de Petri y dejar solidificar. 2. Mantener el medio de TBA a 50 ºC.

3. Agregar el Cloruro de calcio al TBA y homogeneizar. 4. Incorporar el volumen necesario de GRL al TBA. 5. Mezclar suavemente con movimientos circulares.

6. Agregar el agar TBA con los GRL en las placas de Petri con TSA. 7. Identificar a las placas como placas de ensayo.

8. Conservar a 4 ºC.

9. Utilizar dentro de los 15 días posteriores a su preparación. Placa de AGRSL

Composición

Para 15 ml de agar (una placa)

Recomendación

Se debe emplear sangre fresca, de no más de 10 días de extraída. Preparación de la placa AGRSL

1. Mantener el medio de TBA a 50 ºC.

2. Incorporar el volumen necesario de GRSL al TBA. 3. Mezclar suavemente con movimientos circulares.

4. Dispensar el agar TBA con los GRSL en las placas de Petri. 5. Identificar a las placas como placas controles.

6. Conservar a 4 ºC.

7. Utilizar dentro de los 15 días posteriores a su preparación.

Agar Base triptosa (TBA) 10 ml

Agar TSA 10 ml

Cloruro de calcio 1M 0,1 ml

Glóbulos rojos lavados (GRL) de sangre desfibrinada de cabra u

oveja

0,5 ml

Agar Base triptosa (TBA) 15 ml Glóbulos rojos sin lavar (GRSL) de

sangre desfibrinada de cabra u oveja

Preparación de los componentes de las placas de AGRL y AGRSL ¾ TBA

Composición

Preparación

1. Disolver los componentes en un litro de agua destilada 2. Calentar a ebullición hasta disolución completa

3. Esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 minutos. 4. Dejar enfriar

5. Mantener en baño de agua termoestatizado a 50 ºC para la preparación de las placas de AGRL y AGRSL

Nota: el TBA puede ser reemplazado por agar base sangre (Difco) ¾ Cloruro de calcio 1M

Composición Para 10 ml

Cloruro de calcio 1.11 g Preparación

1. Disolver el cloruro de calcio en 10 ml de agua destilada.