CAPÍTULO I EL GEN FROST (Fst)
OBSCURA DE DROSOPHILA
D. MELANOGASTER Y SUBOBSCURA
La divergencia en el gen Fst se ha analizado independientemente en los grupos
melanogaster y obscura de Drosophila. El motivo de no haber realizado un análisis
conjunto es la dificultad de alinear con una cierta seguridad las secuencias del gen entre ambos grupos de especies debido principalmente al elevado número de adiciones/deleciones que se han producido en la región de los motivos PEEST durante la divergencia. En la figura I.15 se presenta un posible alineamiento de la proteína codificada por el gen Fst entre D. melanogaster y D. subobscura. La similitud más elevada de la secuencia aminoacídica de ambas especies se encuentra en los primeros 26 aminoácidos de la región N-terminal de la proteína. El alineamiento del resto de la proteína es muy dudoso y puede considerarse tan solo una aproximación. Sin embargo, este alineamiento entre D. melanogaster y D. subobscura se utilizó para estimar la divergencia sinónima y no sinónima en la región codificadora del gen Fst entre estas especies. La estima de divergencia sinónima (Ks = 1.232) es comparable a las estimas
encontradas en 17 genes secuenciados en D. melanogaster y D. subobscura recopilados en Munté et al (1997) y que oscilan entre 0.536 en el gen Sxl y 1.586 en el gen Adhr. Por el contrario, el gen Fst presenta la estima de divergencia no sinónima (Ka = 0.512)
más elevada en comparación a la detectada en los otros genes secuenciados en ambas especies. Estas estimas oscilan entre 0.021 en el gen Antp y 0.405 en el gen Cp15. Este resultado indicaría que el gen Fst está evolucionando rápidamente en las posiciones no sinónimas.
La evolución rápida del gen Fst se manifiesta tanto por la elevada divergencia no sinónima como por el acumulo de inserciones/deleciones. De hecho, una de las características particulares del gen Fst es la presencia de una serie de repeticiones (PEEST) que se ubican en la región C-terminal de la proteína. El número de repeticiones en D. melanogaster es de 10 pero en D. subobscura se reduce a 1. De igual forma, el número de motivos que difieren en uno de los residuos (PEDST, TEEST, PVEST, etc) en D. melanogaster (13) es mayor que en D. subobscura (9). Esta
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82 distintas especies oscila entre 340 y 195 aminoácidos y esta longitud coincide únicamente en tres de las especies estudiadas (D. subobscura, D. madeirensis y D.
guanche).
El alto porcentaje de treoninas (T) detectado en la proteína FROST en las especies de Drosophila analizadas es una característica que también se ha observado en diferentes Antifreeze Proteins (AFPs) de insectos (Gram et al. 1997; Duman et al. 1998). No obstante, la estructura fundamental de las anteriores proteínas consiste de una serie de repeticiones de 12 aminoácidos (CTXSXXCXXAXT) que se encuentran en tándem
(Gram et al. 1997; Liou et al. 1999). La estructura tridimensional propuesta para una AFP del escarabajo Tenebrio monitor (TmAFP) (Liou et al. 1999; Liou et al. 2000) es una hélice formada por siete repeticiones de 12 residuos donde la mayoría de los residuos de treonina se alinean de forma regular en uno de los lados de la proteína para formar una superficie que interactúe con los cristales de hielo. Adicionalmente, se ha propuesto que la treonina actuaría como un residuo de unión al hielo en diferentes AFPs, principalmente en la AFP de tipo I (Knight et al. 1991) y la AFP de tipo III (Chao et al. 1994). Por lo tanto, a pesar de que en las especies de Drosophila estudiadas en este trabajo los pares de treoninas hallados en la proteína FROST se encuentran separados por un número de residuos que es bastante variable, el alto contenido de este aminoácido en la proteína FROST podría estar relacionado con su función.
Otra característica de la proteína Fst en las especies del grupo melanogaster es la presencia de una serie de prolinas (P) consecutivas en la primera mitad de la proteína.
Figura I.15 Alineamiento de la proteína codificada por el gen Fst en D. melanogaster y D. subobscura. Los
puntos (.) indican el mismo aminoácido que en la secuencia de D. melanogaster. Los guiones (-) corresponden a deleciones de aminoácidos. D. mel, D. melanogaster; D. sub, D. subobscura
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El número de prolinas varía tanto entre especies como dentro de especie ya que se ha detectado polimorfismo en esta característica en D. melanogaster. La forma mayoritaria en esta especie presenta 10 prolinas consecutivas, mientras que este número es 7 en D.
simulans y D. yakuba, 5 en D. mauritiana, y 9 en D. erecta. Sorprendentemente, las
especies del grupo obscura han perdido esta característica. Se requeriría un análisis funcional comparativo entre las especies de los grupos melanogaster y obscura para determinar si la pérdida de los residuos de prolina afecta a la función de la proteína FROST.
La divergencia del gen Fst en el grupo melanogaster se analizó en un total de 5 especies. La estima de la divergencia sinónima entre D. melanogaster y D. simulans (Ks
= 0.144) puede considerarse relativamente elevada si se compara con la estima promedio de la divergencia nucleotídica silenciosa de 19 genes autosómicos analizados en ambas especies (Ksil = 0.108) (Begun y Whitley 2000). De hecho, únicamente 3 de
los 19 genes están evolucionando más rápidamente en las posiciones sinónimas que el gen Fst. Un argumento similar es válido al considerar la divergencia no sinónima. La estima de Ka en el gen Fst de 0.035 es superior a la estima promedio para los mismos
genes (Ka = 0.011) (Begun 2002). También en este caso sólo 3 de los 19 genes
presentan estimas de Ka superiores a las del gen Fst.
La relación Ka/Ks es siempre inferior en las comparaciones entre las especies del
grupo melanogaster que en las comparaciones entre especies del grupo obscura. De hecho, la estima promedio de la relación Ka/Ks en las especies del grupo melanogaster y
del grupo obscura es 0.198 y 0.325, respectivamente. Este resultado indicaría que las constricciones funcionales de la proteína FROST son menores en el grupo obscura, lo que comporta una menor selección purificadora en este grupo de especies.
En general, los árboles filogenéticos reconstruidos de acuerdo a la divergencia del gen Fst están de acuerdo con las relaciones filogenéticas de las especies analizadas. Tan solo se detecta una discrepancia en el árbol reconstruido en base a la divergencia sinónima en el grupo melanogaster (figura I.11B) en el que D. simulans aparece más estrechamente relacionada con D. melanogaster que con D. mauritiana. Sin embargo, está generalmente aceptado que D. simulans es evolutivamente más cercana a D.
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84 a la divergencia del gen Fst. Los árboles filogenéticos de las figuras I.11A y I.11C muestran que la rama que conduce a D. erecta es considerablemente más larga que la que conduce a D. yakuba. La filogenia obtenida permite la aplicación del relative rate
test utilizando cualquier especie del complejo melanogaster como outgroup. Utilizando D. melanogaster como especie outgroup se detectó una diferencia altamente
significativa en la tasa de sustitución nucleotídica entre los linajes de D. yakuba y de D.
erecta causada por una aceleración en la tasa de sustitución no sinónima en el linaje de D. erecta. De las 32 sustituciones aminoacídicas fijadas en el linaje de D. erecta, 12
están ubicadas en la región N-terminal de la proteína entre las posiciones 25 y 75. La mayoría de estos 12 reemplazamientos, un total de 8, son radicales con valores elevados de distancia físico-química entre los aminoácidos. Por lo tanto, la selección positiva podría haber causado la fijación de algunos de estos reemplazamientos posiblemente debido a cambios beneficiosos en la especificidad de la proteína.
Las estimas de divergencia nucleotídica en las regiones no codificadoras de todas las especies son bastante inferiores a las detectadas en las posiciones sinónimas de la región codificadora. Esta constricción en las posiciones no codificadoras es más evidente en la región 5’ flanqueante del gen Fst en las especies del grupo melanogaster y en la región 3’ en las especies del grupo obscura. La diferente longitud de las regiones 5’ y 3’ analizadas en ambos grupos de especies podría explicar esta discrepancia. No obstante, la elevada diferencia entre la divergencia sinónima y la divergencia de las regiones no codificadoras indica que la selección purificadora está manteniendo regiones importantes posiblemente involucradas en la regulación del gen Fst. Sin embargo, hasta el momento las regiones promotoras y reguladoras de este gen no han sido caracterizadas.
Las estimas del sesgo en el uso de codones sinónimos son más elevadas en las especies del grupo melanogaster que en las del grupo obscura. Se ha propuesto que el ambiente recombinacional puede afectar al uso de codones sinónimos (Kliman y Hey 1993; Munté et al. 1997) en el sentido de que el codon bias es inferior en las regiones de baja recombinación debido a una menor eficacia de la selección débil en el mantenimiento de los codones preferentes. Sin embargo, el gen Fst se encuentra en una región con niveles reducidos de recombinación en, por ejemplo, D. melanogaster en comparación con D. subobscura. Por lo tanto, las diferencias en el ambiente recombinacional no parecen poder explicar las diferencias detectadas en el uso de codones sinónimos entre las especies de los grupos melanogaster y obscura. Aunque el
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menor codon bias en las especies del grupo obscura podría indicar una mayor divergencia sinónima en estas especies, este hecho no se refleja en los datos obtenidos ya que, como se ha indicado, la relación Ka/Ks es superior en las especies del grupo obscura que en las del grupo melanogaster. Sin embargo, los menores niveles de las
constricciones funcionales en algunas proteínas permiten acumular un mayor número de sustituciones no sinónimas causando un incremento en el valor de la relación Ka/Ks.