Meristemo apical

Durante el periodo de cultivo se lograron obtener embriones somáticos en estado cotiledonar bien desarrollado pero en ninguno de ellos se vio la emergencia de primordios foliares normales (Figura 20), las imágenes de los cortes anatómicos indican poca actividad en el meristemo, escasas células se encontraron en división (mitosis), es preciso señalar que la mayoría de la células se encuentran en interfase. También se distinguen, primordios de cotiledones.

En contraparte, se vio que el meristemo apical de una planta adulta de linaloe que se conservó en invernadero (Figura 21), mantenía una intensa actividad mitótica, en ella se observaron muchas células en mitosis, además de un par de primordios foliares y un tricoma de tipo glandular que presenta un pie corto y una cabeza globosa multicelular (Castro y Torrecilla, 2013). Es posible observar el tamaño reducido que presenta el meristemo del embrión somático y un ligero abultamiento en ambos, también se distinguen células de la protodermis más grandes que las del resto del meristemo en la planta, mientras que las del embrión somático parecen ser del mismo tamaño.

Figura 20. Meristemo apical (ma) de un embrión somático, cm: células en mitosis, ci: células en interfase, pc: primordio cotiledonar. Objetivo 40 x.

Figura 21. Meristemo apical (ma) de una planta adulta de linaloe, cm: células en mitosis, ci: células en interfase, pf: primordio foliar y t: tricoma glandular. Objetivo 40 x.

Es posible que la poca o nula actividad del meristemo caulinar en el embrión somático se deba a una variación somaclonal, resultado de la intensa división celular que sufre el tejido embriogénico, derivado de los constantes subcultivos, provocando la falta de germinación de los embriones y la ausencia de la aparición de hojas verdaderas o normales de la especie (Wilhelm, 2000). Probablemente el gen STM (del inglés shootmeristemless), se expresa para formar las células que constituyen el meristemo apical y al no estar activado suprime la diferenciación celular y como consecuencia, las células permanecen indiferenciadas (Taiz y Zeiger, 2006). Por otro lado puede suceder que el meristemo caulinar, carezca de reservas de carbohidratos o proteínas tal como sucede con Citrus (Cabasson, 1997), y es probable que este tipo de compuestos sólo sean aportadas por el medio de cultivo. En lo que respecta al tamaño y abultamiento del ápice caulinar se debe a la poca diferenciación de células apicales, en arabidopsis Mordhorst et al. (2002) indicaron que el meristemo de embriones somáticos mutantes no estaba presente y los que no eran mutantes si lo tenían. Schoof et al. (2000) mencionaron que en arabidopsis la células epidérmicas y sub-epidérmicas se dividen anticlinalmente y las células internas aleatoriamente para formar el tejido interno tal como sucede en linaloe. Sin embargo aún no fue posible dilucidar la razón por la cual el meristemo caulinar de los embriones de B. linanoe no se desarrolló, ya que en otros estudios con distintas fuentes de carbono y hormonas no se logra la aparición de hojas normales.

4.8 Extracción y cuantificación por reflujo de linalol y acetato de linalol por medio de cromatografía de líquidos a alta presión (HPLC)

Los resultados de la extracción de linalol y acetato de linalol presentan variaciones en su concentración en las distintas muestras de material vegetal in vitro, en el Cuadro 6 se muestran las cantidades de extracto por sistema de cultivo en combinación con distintos tipos de luz, el mejor peso de extracto lo tuvo la luz roja después la luz blanca, posteriormente sistema tradicional y por último luz azul. Es probable que el tipo de radiación y el sistema de cultivo ejerzan un estímulo para la producción de distintos compuestos metabólicos, ya que como se muestra más adelante el extracto conserva metabolitos secundarios del interés de este estudio, como es linalol y acetato de linalol pero se presentan en distinta concentración.

Cuadro 6. Datos de la extracción de aceite de embriones y masas proembriogénicas de linaloe a reflujo.

Sistema de cultivo y tipo de luz Peso de extracto (g)

ST y fluorescente 0.43

SIT y blanca 1.07

SIT y azul 0.35

SIT y roja 2.01

ST: sistema tradicional y SIT: sistema de inmersión temporal.

El rendimiento de la extracción de aceite es bueno, porque se demuestra la síntesis de compuestos metabólicos que de primera mano parece ser poca cantidad pero confirman su presencias en las masas

25). Sin embargo, debido a las condiciones del método se aislan otros componentes que afectan el aroma y la consistencia de la esencia, lo anterior se explica debido a que los terpenos linalol y acetato de linalol tienen una presión de vapor alta lo que provoca que se evaporen con el tiempo y la temperatura del secado. Esto hace probable que el rendimiento de los compuestos sea mínima, pero suficiente para confirmar su presencia.

El método tradicional para obtener esencia de madera o de frutos de B. linanoe es por arrastre de vapor, método que requiere por lo menos 1.0 kg de muestra ya que los rendimientos son del 0.15 % - 0.20 % para tallo fresco y de 1.2 % - 2.0 % para fruto. (Sánchez-Arreola, 2013). Por lo anterior para hacer una comparación se requeriría contar con la misma cantidad de material embriogénico.

Figura 22. Cromatograma de la esencia de linalol (circulo gris) y acetato de linalol (circulo negro) de masas proembriogénicas y embriones somáticos producidos en el sistema tradicional y luz blanca fluorescente.

Figura 23. Cromatograma de la esencia de linalol (circulo gris) y acetato de linalol (circulo negro) de masas proembriogénicas y embriones somáticos producidos en el sistema de inmersión temporal y tipo de luz roja.

Figura 24. Cromatograma de la esencia de linalol (circulo gris) y acetato de linalol (circulo negro) de masas proembriogénicas y embriones somáticos producidos en el sistema de inmersión temporal y tipo de luz azul.

Figura 25. Cromatograma de la esencia de linalol (circulo gris) y acetato de linalol (circulo negro) de masas proembriogénicas y embriones somáticos producidos en el sistema de inmersión temporal y tipo de luz blanca.

La concentración de los compuestos se determinó con las curvas de calibración con los datos obtenidos del área bajo la curva del pico del cromatograma de HPLC, contra las soluciones tanto de linalol (0.1 a 1.0 mg/mL) (Figura 26), como de acetato de linalol (0.1 a 1.0 mg /mL) (Figura 27).

Figura 26. Curva de calibración de linalol.

En el Cuadro 7, se muestran los porcentajes de la concentración de linalol y acetato de linalol, respecto de cada una de las extracciones, en ella se observa que existe mayor producción de acetato de linalol en el sistema tradicional y en menor medida linalol, en contraparte en el sistema de inmersión temporal se distingue más producción de linalol y menor de acetato de linalol, aunque mayor concentración con luz roja, seguido de luz azul, finalmente luz blanca, sin embargo en todas las muestras en proporciones muy bajas respecto al extracto.

Tomando en cuenta que sólo se usó una línea embriogénica se puede deducir claramente que la producción se ve afectada por factores abióticos en un mismo genotipo, ya que con información antes mencionada se indica que la producción de metabolitos es distinta entre individuos de la misma especie. (Rzedowski et al., 2004). En general se puede derivar que el factor determinante para la producción de ambos metabolitos secundarios es el físico o ambiental, por un lado en el sistema tradicional existió un relativo estrés sobre el material vegetal ya que no todo el callo o masa proembriogénica estuvo en contacto con el medio de cultivo, no hubo intercambio gaseoso y se presentó mayor porcentaje de necrosis, por el otro, en el sistema de inmersión temporal existieron condiciones favorables como son: alta humedad relativa, el material vegetal estaba en pleno contacto con el medio de cultivo, poca o nula necrosis y constante remoción de la atmosfera al interior del recipiente, sin embargo hay diferencias de producción en los distintos tipos de luz siendo la luz roja la que indujo mayor

producción de linalol, lo que puede ser resultado de la activación de fotorreceptores y la subsecuente biosíntesis de linalol y acetato de linalol.

Cuadro 7. Porcentaje de la extracción a reflujo de linalol y acetato de linalol, en combinación con distintos tipos de luz.

Linalol en el extracto (mg) Linalol en el extracto % Acetato de linalol en el extracto (mg) Acetato de linalol en el extracto % ST + Luz fluorescente 1.48 0.34 2.09 0.48

SIT + Luz blanca 3.37 0.31 2.09 0.19

SIT + Luz azul 1.50 0.43 0.11 0.03

SIT + Luz roja 17.16 0.85 5.41 0.26

ST: sistema tradicional, SIT: sistema de inmersión temporal

Previamente se ha reportado que el tipo y la concentración de fitohormonas pueden jugar un rol importante con respecto de la acumulación de metabolitos secundarios en callos embriogénicos (Georgiev et al., 2011). en este sentido, en Salvia tomentosa mill. observaron diferencias en la producción de metabolitos de interés, específicamente con altas concentraciones de citocinina y bajas de auxina, las cuales estimularon la producción de ácido oleanólico. Por otro lado, al momento de usar bajas concentraciones de ambas fitohormonas se incrementó la producción de ácido ursólico (Georgiev et al., 2011), y al igual que en este estudio se usaron bajas concentraciones de auxinas y citocininas, esto hace probable que al usar distintas concentraciones se vea un incremento en la producción de algún metabolito secundario de interés.

En Commiphora wightii existió mayor producción de metabolitos secundario en material in vivo vs in vitro, específicamente en embriones cigóticos y callo embriogénico, entre ellos se registró una diferencia notable 33.1 vs 7.64 μg, el callo no embriogénico presento baja concentración de metabolitos (Kumar et al., 2006). En nuestro trabajo también existe diferencia aunque entre sistemas, esta tendencia favorable se dio a favor del material vegetal que se produjo en el sistema tradicional contra lo producido en el sistema de inmersión temporal, en ese sentido, lo que se vio con Commiphora wigtii fue que los metabolitos secundarios producidos por embriones cigóticos se dan gracias a factores inherentes al ambiente en el que se desarrollaron estos embriones, esos mismos factores son distintos y manipulables en el cultivo in vitro, es así que nuestro estudio presenta similitudes con el estudio de Kumar et al. (2006) con respecto del contraste que hay entre dos sistemas de cultivo que comparten ciertas características, pero que no dejan de ser distintos y se observa que al usar uno u otro se afecta la producción tanto de linalol como de acetato de linalol.

Sánchez-Arreola, (2011) encontró mayor producción de acetato de linalol y menor de linalol pero en concentraciones mayores a las obtenidas en el presente estudio (60 % y 39 %), con material nativo de Olinalá Guerrero, de igual forma obtuvo tendencia similar con material de Morelos (64 % y 15 %), específicamente de la esencia de madera y frutos, con la misma técnica que se usó en este estudio, es así que el material vegetal nativo contiene más acetato de linalol y menos de linalol. Pero en estudios realizados con callos embriogénicos y no embriogénicos de linaloe Arellano et al. (2009b) mencionan una mayor producción de esencia de linaloe en los callos no

embriogénicos (54.5 mg) con rendimiento del 11 % p/v de acetato de linalol y 2 % p/v de linalol, en comparación con los embriogénicos (32.4 mg) con 3 % p/v de acetato de linalol y 2 % p/v de linalol, estos resultados demuestran que la síntesis de este tipo metabolitos son menormente sintetizados en tejidos embriogénicos, sin embargo la síntesis de linalol en ambos callos fue similar respecto del p/v, estos resultados difieren ya que en el sistema de inmersión temporal existe mayor síntesis de linalol que de acetato de linalol mientras que en el sistemas tradicional con agar existe más acetato de linalol que linalol, lo cual concuerda con lo mencionado por Arellano et al. (2009b) y esto hace suponer que las condiciones ambientales propias de los recipientes deriven en la síntesis de estos compuestos.

Como ya se mencionó es probable que esta respuesta se deba al ambiente en donde se desarrolla esta especie, es por ello que en este estudio se obtienen resultados a la inversa, es decir más concentración de linalol y menos de acetato de linalol en el sistema de inmersión temporal, derivado de cambios en el ambiente o bien a una posible hidrólisis del acetato de linalol por la cantidad de agua en el medio de cultivo. Cabe recordar que la biosíntesis de metabolitos secundarios suele ser el resultado de periodos de estrés causados por enfermedades, ataques de microorganismos o al ambiente, es por ello que el material vegetal nativo presenta las concentraciones antes mencionadas, y es factible que el material que proviene de cultivo in vitro tradicional presente este patrón de respuesta, por el estrés que recibe el material vegetal al interior del recipiente y el material que proviene de cultivo en inmersión temporal presente poco o nulo estrés al interior del RITA®_.

5. CONCLUSIONES

 Es factible la utilización del sistema de inmersión temporal tipo RITA® para la producción de embriones somáticos de linaloe, ya que es un sistema mucho más eficiente que el sistema tradicional con agar. Es indiscutible que este sistema supera al sistema tradicional y es posible utilizarlo para otros cultivos y explantes con resultados seguramente favorables.

 Se observó que el proceso embriogénico en B. linanoe sigue las mismas etapas de desarrollo que un embrión normal, sin embargo en algunas preparaciones se vio que los embriones cotiledonares no germinan, por lo que es necesario probar otras alternativas para conseguirla, a la vez que se requiere de pruebas bioquímicas para dilucidar qué es lo que está pasando con el embrión.

 En ambos sistemas de cultivo se consiguió la síntesis de linalol y acetato de linalol, pero en proporción muy baja, es posible que las condiciones de los sistemas de cultivo generen esta respuesta, por lo que tal vez estresando al tejido sea posible obligarlo a sintetizar más compuestos metabólicos. También es posible que el método de extracción a reflujo generé una perdida por evaporación de los metabolitos de interés, debido que a las cantidades de masa embrionaria obtenida en cada método no fue sufriente para aplicar el método de extracción por arrastre de vapor y no se pudo hacer una comparación con los rendimientos obtenidos por este método en tallo fresco y fruto.

 Se generó un protocolo de cultivo en el sistema de inmersión temporal, el cual aporta las condiciones y pasos a seguir para producir otros cultivos de interés.

6. LITERATURA CITADA

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