MET y reconstrucción 3D de partículas individuales

La microscopía electrónica de transmisión (MET) (Bozzda J, et al., 1992), (Stahlberg

H, et al., 2008) es una de las técnicas más potentes y con mayor potencial de desarrollo en la determinación de la estructura de macromoléculas debido al desarrollo de microscopios y detectores cada vez más potentes y precisos (Orlova, et al., 2011), (Llorca O, 2005). Mediante el uso de técnicas de reconstrucción de partícula individual, hoy en día es capaz de llegar a resolución atómica (Yu X, et al., 2008), (Zhang X, et al., 2008) tal como lo hacen la Cristalografía de Rayos X y la Resonancia Magnética Nuclear (RMN) pero sin presentar los inconvenientes y limitaciones de estas técnicas estructurales.

En la Cristalografía de Rayos X, la principal limitación es la obtención de cristales con una alta calidad, concentración y pureza de la muestra (Berger J, 2008). Otra importante limitación es relativa al tamaño de la molécula, problema que comparte la RMN, puesto que, a mayor tamaño, mayor es la complejidad de los espectros de difracción y resonancia obtenidos.

La ME se encuentra limitada en su resolución (Lander G, et al., 2012). Las aberraciones en las lentes, el bajo contraste de las imágenes, el daño de radiación y las técnicas de preparación de la muestra provoca que la resolución atómica teórica sea difícil de conseguir. No obstante, el desarrollo de la instrumentación y los métodos, junto al avance en la capacidad de computación y software ha acercado este límite (Fernandez- Leiro, et al., 2016). La ME presenta como ventaja frente a estas técnicas que emplea una menor cantidad de muestra, no es necesario altas concentraciones de la misma para su análisis, y se pueden utilizar en un amplio rango de disoluciones. Asimismo, el tamaño de la muestra no es una limitación tan importante, ni tampoco el que la muestra pueda ser homogénea o formada por dos o más macromoléculas (Wilhelm R, et al., 2012).

1.4.1 El microscopio electrónico de transmisión

El microscopio electrónico de transmisión se puede descomponer en 4 partes principales. Una fuente de emisión, una columna de aceleración de electrones, lentes

electromagnéticas y un sistema de detección. La fuente de iluminación es un filamento o cátodo, generalmente Tungsteno, Wolframio o Hexaboruro de Lantano (LaB6) del cual se extraen electrones y se aceleran por la acción de un elevado voltaje, entre 80kV y hasta 400kV. Para conseguir un haz centrado de electrones se emplean lentes condensadoras, y mediante bombas de alto vacío se evita que los electrones choquen con el aire contenido en la columna. De este modo los electrones pueden atravesar la columna sin desviarse, y consiguen interaccionar con la muestra.

La muestra depositada en una rejilla de ME se introduce en la columna mediante un brazo que se sitúa en la trayectoria del haz de electrones, que al incidir en la muestra se desvían y se recogen en un sistema de detección. La imagen que se genera se toma como una proyección de la muestra de estudio (Milazzo AC, 2005). Hace años se utilizaba una placa fotográfica para tal fin, que se substituyó por una cámara digital CCD (del inglés,

Charge-Coupled Device). Actualmente el empleo de detectores directos (Fernandez- Leiro, et al., 2016) con chips que poseen mayor resistencia a la radiación de electrones ha mejorado la eficiencia en la detección, y como consecuencia, ha revolucionado la ME.

1.4.2 Preparación de muestras para ME

El objetivo principal a la hora de preparar las muestras en ME es el de preservar la muestra de la radiación electrónica y del alto vacío dentro del microscopio electrónico. Hay dos técnicas principales, la tinción negativa (Ohi, et al, 2004) y la Ultracongelación o Criomicroscopía Electrónica (Dubochet, et al, 1988).

• Tinción Negativa

La tinción negativa se basa en reemplazar la solución de la muestra por una sal de metal pesado, como las sales de Uranilo, acetato y formiato principalmente, que consigue aumentar el contraste. Esta forma una matriz amorfa que ayuda a proteger la muestra de la radiación. La ventaja principal de esta técnica es que es sencilla de llevar a cabo y se puede aplicar a muestras heterogéneas y de muy diverso tamaño. La desventaja es que limita la resolución al tamaño de la sal de metal pesado empleada en la tinción en torno a 20 Å (Fig. 1.10).

Introducción

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• Crio-microscopía Electrónica

En la crio-microscopía electrónica la muestra se encuentra embebida en su propio tampón a -180 °C, que se consigue empleando N2 líquido. La congelación es muy rápida y consigue que el agua presente en la muestra forme hielo vítreo, evitando la formación de cristales que provocarían un daño importante en la muestra. Mediante esta técnica se consigue que la muestra se preserve del daño provocado por la radiación, aunque las imágenes que se obtienen presentan un bajo contraste. Este se puede incrementar cambiando el foco cuando se obtienen las micrografías. Mediante esta técnica se puede obtener resolución cuasi-atómica (Jiang W, et al., 2005), (Baker L, et al., 2010), (Fernandez-Leiro, et al., 2016) (Fig. 1.11).

1.4.3 Adquisición de datos

La toma de micrografías se realiza mediante la técnica de “mínima dosis”, cuyo objetivo es limitar la radiación que incide sobre la muestra, minimizando el daño provocado por la dosis de electrones, que no debe sobrepasar los 10 e-

/Å2

, aunque más recientemente el empleo de pequeños fragmentos de vídeo en la adquisición, pueden soportar 20-30 e-

/Å2

. Antes de tomar la micrografía se ajustan previamente las

Fig. 1.10 Técnicas de preparación de muestras para ME. (A) En la tinción negativa el espécimen queda embebido en una matriz amorfa que sustituye al tampón de la muestra.

(B) En la

criomicroscopía las partículas se congelan atrapadas en una fina capa de hielo vítreo que preserva su conformación nativa. !! _!! "!#$%%&' ($)*+,)+-.&' !%!)/*01$)& 2'(( "#$%& "#$%& ' 3$1)$01'4!5&/$6& ( 7+15!%&)$01 !! _!! "!#$%%&' ($)*+,)+-.&' !%!)/*01$)& 2'(( "#$%& "#$%& ' 3$1)$01'4!5&/$6& ( 7+15!%&)$01 !

MET