2. Capítulo 2: Microorganismos eficientes
2.5 Metodología
Para dar cumplimento a este objetivo, primero se definieron las zonas homogéneas y los sitios de muestreo en los tres municipios de interés, a través de la siguiente estrategia.
2.5.1 Definición de las zonas homogéneas y sitios de muestreo
Con base en el análisis de las variables clasificatorias de clima, suelo, geomorfología y características como el uso de la tierra, conflictos y las zonas agroecológicas (Banco de Imágenes del Instituto Geográfico Agustín Codazzi (IGAC) – Corpoica) se definieron las diferentes zonas geomorfológicos homogéneas (Kv, C, Cu, Cx, Cj, Cu y W), con la posterior generación de los mapas de muestreo correspondiente a cada uno de los municipios de interés, en donde se definieron las zonas para la toma de muestra.2.5.2 Toma
de
muestras
de
los
suelos
para
análisis
físicoquímicos y microbiológicos en las zonas definidas
Para los análisis microbiológicos se tomaron 200 g de suelo rizosférico asociado a plátano, de 10 -15 cm de profundidad. Mientras que para el análisis químico se realizó una excavación a 30 cm de profundidad y se tomó, con una pala, una muestra compacta de aproximadamente 1 kg. La muestra de suelos en anillos (1 anillo por muestra) fue tomada para el análisis físico de los suelos (fotografía 2-1; fotografía 2-2).Fotografía 2-1: Toma de muestra para análisis químicos. (A) Excavación a 30 cm para la
Fotografía 2-2: Toma de muestra realizada para análisis físico del suelo. A. Upland para
la toma de muestra B. Upland con la muestra de suelo.
2.5.3 Aislamiento de bacterias ácido lácticas
Para el aislamiento de bacterias ácido lácticas (BAL) se utilizaron dos métodos: Aislamiento directo
A partir de las muestras de suelo rizosferico se realizaron diluciones seriadas hasta 106; las diluciones de 104 a 106 fueron sembradas por duplicado, con incubación a 37ºC en condiciones de microaerofilia con Gaspak (ANAEROGEN) en jarras de anaerobiosis por un período de 48 h.
Aislamiento a partir de medios selectivos
En este procedimiento 1 g de suelo rizosferico se adicionó a 90 ml de caldo MRS (Man, Rogosa y Sharpe), se incubaron por 72 h a 37ºC en condiciones aerobias. Cumplido este tiempo fue realizada una siembra en superficie de 10 µl del caldo MRS en agar MRS, las cajas fueron llevadas a incubación por 48 h a 37ºC en aerobiosis (procedimiento realizado por duplicado). Para obtener aislamientos puros se realizaron pases sucesivos que fueron confirmados por coloración de Gram.
Prueba de catalasa
A las colonias aisladas se les realizó la prueba de la catalasa y aquellas con resultado negativo se clasificaron como BAL.
2.5.4 Aislamiento de bacterias fotosintéticas no sulfurosas
Para el aislamiento de bacterias fotosintéticas no sulfurosas (BFNS) se utilizaron dos métodos Aislamiento directo
El procedimiento realizado fue igual que para BAL, excepto por el período de incubación de 7 días, a una temperatura de 30°C, con presencia de luz; el medio de enriquecimiento utilizado fue caldo Rhodospirillaceae (Biebl, et al., 1982).
Aislamiento a partir de columna de Winogradsky
El método propuesto por Tamer en 1989 (Yasa, et al., 2006) fue el utilizado. La columna se dejó expuesta a la luz de 4 a 6 semanas, a partir de la zona con coloración naranja – café (fotografía 2-3), se realizaron diluciones de 101 hasta 103 por duplicado y fueron sembradas en tubos con 10 ml de agar semisólido a los que se les agregó parafina, la incubación se realizó a temperatura ambiente con exposición a la luz blanca directa por 3 semanas (Biebl, et al., 1982).
Al cabo de este tiempo se tomó una asada del pool de colonias púrpuras, a partir de la cual se realizaron diluciones de 105 a 108 para el roll tube; de la dilución en que las colonias crecieron completamente aisladas, una de esas colonias se sembró en 15 ml de caldo de enriquecimiento dejando en incubación por 1 semana en las condiciones previamente mencionadas. A partir de este cultivo se procedió a aislar nuevas colonias en caja petri (incubación en jarras de anaerobiosis, a una temperatura de 30ºC durante 8 días, con exposición a luz blanca directa).
Fotografía 2-3: Montaje de columna de Winogradsky donde se observa zona color
naranja* luego de cuatro semanas de incubación.
2.5.5 Aislamiento de actinomicetos
El aislamiento de actinomicetos se realizó según lo descrito en el manual de Bergey’s (2000). A partir de las muestras de suelo rizosferico fueron realizadas diluciones de 103 a 105 sembradas de forma masiva en agar avena suplementado con nistatina al 0.1% y agar Yeast Malt Extract (YEM); las colonias típicas de actinomicetos (pulvurentas, arenosas, de diversos pigmentos) se pasaron a un nuevo agar avena, en donde para realizar la identificación microscópica colocando las laminillas estériles en un ángulo de 45º con respecto a la superficie del agar (fotografía 2-4). El tiempo de incubación fue 8 a
*Zona color naranja narannaranja
15 días a temperatura ambiente. Tanto la identificación de las características macroscópicas y microscópicas se realizó de acuerdo a lo descrito en el manual de Bergey’s (2000).
Fotografía 2-4: Montaje de láminas cubre objetos sobre el medio de cultivo agar avena
para la recolección de muestras miceliares y análisis micorsocópicos.
2.5.6 Conservación de aislamientos
Para la conservación a bajas temperaturas de las BAL y las BFNS se tomó 1 ml de medio de cultivo y 1 ml de glicerol estéril al 40 % (concentración final 20%), los cuales se colocaron en crioviales estériles de 2 ml, posteriormente se homogenizaron con ayuda de un vórtex y se almacenaron a -20ºC y a -80ºC. Para el caso de los actinomicetos una vez sembrados y evidenciado el crecimiento y la pureza en agar YEM inclinado, se adicionó aceite mineral previamente esterilizado (conservación inmortal), adicionalmente un raspado de la superficie del micelio se adicionó a crioviales homogeneizándolo con glicerol al 20% para su posterior almacenamiento a -20ºC; protocolo modificado de Franco (2008).