3. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. Diseño experimental en el campo y en condiciones controladas
3.2.2. Metodología complementaria a los métodos para la estimación de la conductancia del
Corrección por “leaks” o fugas de los gases de medición (H2O y CO2) entre el aire en el interior de la
cámara de medición y el aire ambiente.
El equipo que empleamos para medir el intercambio de gases de la hoja es de tipo IRGA (infrared gas analyzer) que, a través de los espectros de absorción del vapor de agua y del CO2, es capaz de
calcular la concentración molar de ambos gases en el interior de la cámara de medición. Sin embargo, las almohadillas que hacen de junta de la cámara y delimitan la cavidad interior a la cámara no son perfectamente estancas y se produce difusión de gases, incluso en contra de gradiente de concentración, a través de las almohadillas y especialmente en los puntos de contacto entre el nervio central de la hoja y las almohadillas. Este efecto es irrelevante cuando las hojas muestran un alto grado de intercambio gaseoso y las condiciones de medida (CO2, temperatura y
humedad relativa) son próximas a las de la atmósfera ambiental. Sin embargo, cuando se trabaja con concentraciones de CO2 mayores o menores a las ambiente o las hojas están altamente estresadas o
la superficie foliar para el intercambio de gases es reducida, el no considerar el efecto de las fugas conlleva desviaciones significativas de los parámetros calculados a través de las mediciones de flujos del IRGA. Entre los parámetros más sensibles al efecto fuga, destaca la concentración de CO2 en los
espacios intercelulares (Ci), parámetro que, como hemos visto anteriormente, interviene en el
cálculo de la conductancia del mesófilo por cualquiera de los métodos estudiados. Las ecuaciones que a continuación se presentan se derivan del trabajo de Rodeghiero, Niinemets y Cescatti (2007) y corresponden a balances de masa de vapor de agua y de CO2 entre la cubeta que engloba la hoja y el
exterior: 𝐸𝑙 = 𝑢𝑖 (𝑊𝑆− 𝑊𝑅) 100𝑆(1 − 𝑊𝑆)− 𝐾𝐻2𝑂 (𝑊𝐴− 𝑊𝑆) 100𝑆 = 𝐸𝐴− 𝐾𝐻2𝑂 (𝑊𝐴− 𝑊𝑆) 100𝑆 𝑒𝑞. (25)
donde, WR ,WS y WA (mmol H2O mol aire-1) representan la fracción molar de vapor de agua del aire
que se usa como referencia (aire de entrada), del aire en la cámara de medición (aire de salida) y del aire que rodea la cámara de mediación, respectivamente. S (cm2) es el área foliar presente dentro de la cámara y que realiza el intercambio de gases, ui es el flujo molar del aire que entra en la cámara
(µmol aire s-1) y KH2O es el flujo molar a la difusión de vapor de agua entre la cámara de medición
(µmol H2O s-1) y EA (mmol H2O m-2 s-1) es la transpiración aparente que nos da el equipo (von
Caemmerer & Farquhar 1981). La ecuación 24 nos muestra que cuando el aire exterior es más seco que el que medimos en el interior de la cámara (WA-WS < 0), la traspiración real (El) es superior a la
medida por el equipo. Y para el CO2:
𝐴𝑛 = 𝑢𝑖 (𝐶𝑅− 𝐶𝑆) 100𝑆 − 𝐶𝑠𝐸𝐴+ 𝐾𝐶𝑂2 (𝐶𝐴− 𝐶𝑆) 100𝑆 = 𝐴𝑛,𝐴+ 𝐾𝐶𝑂2 (𝐶𝐴− 𝐶𝑆) 100𝑆 𝑒𝑞. (26)
73
donde, CR ,CS y CA (µmol CO2 mol aire-1) representan la fracción molar de CO2 del aire que se usa
como referencia (aire de entrada), del aire en la cámara de medición (aire de salida) y del aire que rodea la cámara de mediación, respectivamente y KCO2 es el flujo molar a la difusión del CO2 entre la
cámara de medición (µmol CO2 s-1) y An,A (µmol CO2 m-2 s-1) es la fotosíntesis neta que nos da el
equipo, es decir, sin corrección. La corrección del efecto de los leaks y de la conductancia epidérmica sobre la conductancia estomática y la Ci puede consultarse en el apartado de corrección por la
conductancia epidérmica. Los flujos molares a la difusión del CO2 y del agua se evaluaron para cada tipo de cámara de medición usando una hoja hervida en el microondas según procedimiento descrito en Flexas y otros (2007a).
El método de Laisk
El método se fundamenta en que trabajando a luz no saturante y a bajas concentraciones de CO2,
donde la An es directamente proporcional a la concentración de CO2 en el cloroplasto (Cc), se puede
estimar la Cc que iguala la tasa de carboxilación y la de fotorrespiración a la respiración en luz (Rl) al
construir curvas An/Ci a distintas irradiancias y por tanto con distintas pendientes. El punto de
intersección de las distintas curvas determina en el eje de ordenadas la Rl (con signo negativo) y en
el eje de abscisas el punto aparente de fotocompensación del CO2 (Ci*). Se dice aparente porque el
punto de fotocompensación está definido a nivel de cloroplasto (lugar donde se produce la carboxilación). Para estimar el verdadero punto de fotocompensación del CO2 (Γ*) deberíamos
conocer el valor de las resistencias internas de la célula al paso del CO2 (Tholen y otros 2012). Debido
a la falta de un método experimental válido que estime la resistencia del cloroplasto y de la pared celular independientemente, los métodos enzimáticos resultan más convenientes para estimar Γ* (Galmés y otros 2011b). El uso de luz no saturante es necesario para generar curvas de fotosíntesis limitadas por la regeneración de la RuBP a bajo Ci y obtener pendientes diferenciales entre cada
curva. Si trabajásemos a luz saturante, y por tanto la An vendría limitada por la Rubisco, las curvas
estarían superpuestas y no se podría identificar el punto de intersección. A pesar del uso extendido de regresiones lineales para calcular la intersección de las curvas, un ajuste curvilíneo resulta más conveniente, ya que el propio modelo de Farquhar y otros (1980) implica cierta curvatura.
Figura 25. El método de Laisk, que permite estimar la tasa de respiración mitocondrial (Rl) en el eje
de ordenadas y el punto aparente de fotocompensación del CO2 (Ci*) en el eje de abscisas. Ver texto
para más detalles. Conductancia epidérmica
A través de la cutícula y de la epidermis de las hojas existe una conductancia, tanto de H2O como de
CO2, que debe ser medida e incluida en el cálculo que hace el IRGA del intercambio gaseoso,
especialmente en hojas con tasas de intercambio gaseoso bajo, como son las plantas con estrés hídrico. La contribución de la conductancia epidérmica al vapor de agua (gcw) generalmente es muy
superior a la del CO2 (por ejmplo: gcw = 4 mmol H2O m-2s-1 frente a gcc =0.2 mmol CO2 m-2s-1, datos
para Vitis vinifera (Boyer y otros 1997)). Llamamos conductancia epidérmica frente al término más extendido de conductancia cuticular, porque el método seguido de Araus, Febrero y Vendrell (1991) calcula la pérdida de agua de toda la lámina, es decir, la superficie transpirante incluye a los estomas, aunque tras el momento de pérdida de turgencia estos estén cerrados. Por tanto difiere del método original de Boyer y otros (1997) que mide la transpiración solo de la epidermis adaxial sin estomas, y por tanto la denomina transpiración cuticular. La importancia de la transpiración epidérmica radica en el cálculo que se hace posteriormente sobre la Ci, ya que en el modelo original de von Caemmerer
y Farquhar (1981) se asume que toda la transpiración es a través de los estomas.
Las hojas se recogieron al anochecer y fueron rehidratadas hasta alcanzar plena turgencia. Para ello estuvieron en oscuridad 12 horas y a 4ºC con el peciolo sumergido en agua destilada, una vez repicado bajo agua (Dreyer, Bousquet & Ducrey 1990b). Posteriormente se pesaron para obtener el peso a plena turgencia y se selló el peciolo con pegamento antitranspirante para asegurar que las pérdidas de agua sólo se producen a través de la lámina foliar. En una habitación con temperatura y humedad constante se dejaron secar las hojas al aire y en oscuridad y se tomaron pesadas consecutivas anotando el tiempo transcurrido entre cada pesada (Araus y otros 1991). Este
y = 0.0778x - 5.1126 r² = 0.9992 y = 0.0545x - 4.1081 r² = 0.9915 y = 0.0309x - 3.0592 r² = 0.9942 -6 -4 -2 0 2 4 6 0 50 100 150 200
A
n(μ
mo
l C
O
2m
-2s
-1)
C
i(μmol CO
2mol air
-1)
400 μmol photon m-2 s-1 200 μmol photon m-2 s-1 100 μmol photon m-2 s-1
R
l75
procedimiento se siguió hasta obtener suficientes puntos en el tramo en que la tasa de pérdida de agua se hace constante (Fig. 26). Mediante la deshidratación libre las hojas alcanzaron un contenido hídrico relativo (RWC) entre 85-70 %.
Figura 26. Ejemplo de la pérdida en masa de una hoja como consecuencia de la transpiración. Los puntos en rosa muestran el momento en que se ha producido el cierre estomático y la pérdida en peso de la hoja se debe a la transpiración epidérmica.
Posteriormente, las hojas se secaron en estufa a 65ºC durante 48h para obtener el peso seco. Con la pendiente de la recta mostrada en Fig. 26, la tasa de transpiración epidérmica se calcula inicialmente en gramos de agua transpirados por peso seco de la hoja y hora y posteriormente con la medición del peso foliar específico (LMA) y el cambio a moles (18 gramos por mol de agua) se transforma a las unidades habituales de la transpiración (Ec, mmol H2O m-2 s-1). Para pasar a conductancia epidérmica
aplicamos la siguiente relación gcw = Ec/(VPD/P), donde VPD es el déficit de presión de vapor (kPa) y P
la presión atmosférica (kPa). Siguiendo las fórmulas del Manual del Li-COR (von Caemmerer & Farquhar 1981) se pueden recalcular las variables del intercambio gaseoso como sigue:
La conductancia total al vapor de agua (gtw*), que incorpora la conductancia estomática y la capa
límite en un sistema ternario de gases (aire, vapor de agua y CO2) y viene definida en mol H2O m-2 s-1
por:
𝑔𝑡𝑤∗= (
(𝐸𝑙− 𝐸𝑐)
1000 · (1000 − (𝑊𝑠+ 𝑊2 𝑙))
𝑊𝑙− 𝑊𝑠 ) 𝑒𝑞. (27)
El, es la transpiración total recalculada por efecto de los leaks (mmol H2O m-2 s-1) y Ec la transpiración
epidérmica (mmol H2O m-2 s-1), recalculada a las condiciones de medición (según la VPD y P) como se
describe arriba. y = -0.0111x + 2547.9 r² = 0.9995 2350 2400 2450 2500 2550 2600 2650 2700 2750 2800 2850 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 P eso f reco (mg ) Segundos
𝑊
𝑠=
(𝑅𝐻
𝑆𝑒(𝑇
𝑠)10)
𝑃
𝑒𝑞. (28)
, el la fracción molar de vapor de agua en equilibrio con el aire de la cámara de medición
(mmol H
2O mol
-1air), RH
Ses la humedad relativa en la cámara (%), P es la presión
atmosférica en kPa y e(T
s) es la presión de vapor a saturación en kPa a la temperatura de la
cámara en grados centígrados (Buck 1981):
𝑒(𝑇) = 0.61365𝑒
240.97+𝑇17.502𝑇𝑒𝑞. (29)
𝑊𝑙=
(𝑅𝐻𝑙𝑒𝑎𝑓𝑒(𝑇𝑙)10)
𝑃 𝑒𝑞. (30)
, el la fracción molar de vapor de agua en la cavidad subestomática (mmol H2O mol-1air), que se
considera a saturación (RHleaf = 100%) y e(Tl) es la presión de vapor a saturación a la temperatura
foliar.
A partir del cálculo de la gtw*, por sustracción de la conductancia de la capa límite, se puede calcular
la conductancia estomática al vapor de agua:
𝑔𝑠𝑤∗= 1 1 𝑔𝑡𝑤∗ − 1 𝑔´𝑏𝑤 𝑒𝑔. (31)
donde g´bw es la conductancia efectiva al vapor de agua (BLCond; ID: -34; mol H2O m-2 s-1).
El cálculo de la concentración de CO2 en los espacios intercelulares, una vez considerada la
transpiración epidérmica (Ci’) y los efectos ternarios de vapor de agua sobre el CO2, es:
𝐶𝑖′=
(𝑔𝑡𝑐∗− 𝐸2000 ) 𝐶𝑙− 𝐸𝑐 𝑆− 𝐴𝑛
𝑔𝑡𝑐∗+ 𝐸𝑙2000− 𝐸𝑐
𝑒𝑞. (32)
Donde An es la fotosíntesis neta corregida por los leaks, CS es la concentración de CO2 en la cámara
de medición y gtc* es la conductancia total al CO2 (mol CO2 m-2 s-1).
𝑔𝑡𝑐∗= 1 1.6 𝑔𝑠𝑤∗+ 1.37 𝑔´ 𝑏𝑤 𝑒𝑞. (33)
En la Figura 27. Se puede observar el efecto que tiene la corrección por la transpiración epidérmica (Ec) al vapor de agua en la concentración de CO2 en los espacios intercelulares (Ci). Cuando la
conductancia estomática se reduce, la proporción de la Ec en el total de agua transpirada por la hoja
aumenta. Debido a que el equipo de intercambio gaseoso asume que todo el vapor de agua se transpira a través de los estomas, es necesario realizar las correcciones pertinentes (ecuaciones 17-
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23) tanto en la gsw como en la Ci. El grado de error que se comete al no considerar el efecto de la Ec
en la Ci aumenta exponencialmente por debajo de gsw de 100 mmol H2O m-2 s-1 (Warren y otros
2011).
Figura 27. Efecto de la inclusión de la transpiración epidérmica en la estimación de la concentración de CO2 en los espacios intercelulares (C’i) y en la conductancia estomática al vapor de agua (gsw*).
Los datos proceden de cinco especies de Eucalyptus y dos de Acacia sometidos a estrés hídrico y crecidos en buenas condiciones hídricas (Warren y otros 2011).