Metodología para el estudio de biodisponibilidad

La elección de la metodología empleada en nuestro ensayo se realizó en base a las siguientes premisas: 1) el estudio de la fracción de lipoproteínas ricas en triglicéridos (TRL) durante el metabolismo postprandial permite evaluar las pequeñas variaciones de la concentración de un compuesto en plasma debidas a la absorción de novo frente a la proporción de nutriente endógeno (Jessen y cols, 1988; Van Vliet y cols, 1995; Brown y cols, 2004); 2) en la absorción de la vitamina A (preformada o como carotenoides provitamínicos) tiene lugar la esterificación del retinol con ácidos grasos de cadena larga, su posterior incorporación a QM, y finalmente, la secreción de los QM a torrente linfático (Li & Tso, 2003); 3) en condiciones de ayuno no hay ésteres de retinilo presentes en plasma o si los hay son en concentraciones muy bajas (Blomhoff, 1994); 4) la presencia y concentración de ésteres de retinilo en el plasma después de la administración de vitamina A ha sido utilizada como un indicador de la presencia de quilomicrones y quilomicrones remanentes (Berr y cols, 1984; Renuka y cols, 2001)

Cuando se analiza plasma procedente de metabolismo post-prandial los ésteres de retinilo se encuentran fundamentalmente en quilomicrones grandes y cantidades muy pequeñas en lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) (Harrison, 2005). En contraste con los triglicéridos o ésteres de colesterol y otros lípidos (ej. α-tocoferol), los ésteres de retinilo no están presentes en otras lipoproteínas como IDL, LDL o HDL.

116 La utilización de los ésteres de retinilo de quilomicrones como marcador de lipoproteínas de origen intestinal viene avalada por tres razones:la vitamina A es incorporada dentro de las lipoproteínas como palmitato de retinilo por el intestino durante la absorción de la grasa;el intercambio del palmitato de retinilo entre lipoproteínas es mínimo o inexistente al menos durante las primeras 6-8 horas (Krasinski y cols, 1990) después de la ingesta y porque el palmitato de retinilo permanece asociado con la misma lipoproteína desde su secreción por el intestino hasta su incorporación al hígado (Lemieux y cols, 1998). No obstante, la cuestión de si los ésteres de retinilo son el marcador más fiable de las lipoproteínas de origen intestinal o si es la concentración de la apolipoproteína apo B-48 es todavía objeto de discusión (Ruotolo y cols, 1992; Renuka y cols, 2001).

En nuestro estudio, la determinación de la vitamina A en TRL nos ha proporcionado información cualitativa sobre la respuesta (ésteres de retinilo presentes) tras la ingesta de los distintos tipos de leche y cuantitativa respecto al tipo de leche que provocaba mayor respuesta, el tiempo en el que la concentración de ésteres de retinilo alcanza el máximo, la recuperación de niveles basales y el AUC para calcular la cantidad de retinol absorbida.

Aunque está descrita la transferencia de vitamina E entre lipoproteínas durante el período postprandial, la absorción de la vitamina E a partir de leches comerciales también se valoró en TRL y en suero, pero no se obtuvo una respuesta valorable a lo largo del tiempo del estudio. Según un reciente estudio, la utilización del marcaje mediante isótopos estables parece el método de elección para detectar cambios en la absorción de vitamina E a partir de alimentos enriquecidos (Bruno y cols, 2006), ya que las cantidades de nutrientes ingeridas a partir de estos alimentos no son muy altas (cantidades próximas a las RDA) en comparación con las aportadas por los suplementos o preparados comerciales. En cuanto a la vitamina E,

en el planteamiento de este estudio no se contempló la idea de modificación de un alimento que ya había sido modificado por la industria (enriqueciéndolo con vitaminas), y el objetivo era realizar los ensayos de biodisponibilidad con leche comercialmente disponible.

El método empleado para el aislamiento de TRL es el descrito por Griffths y cols. (1994) para el estudio del metabolismo lipídico postprandial y ha sido utilizado en nuestro laboratorio en estudios previos de biodisponibilidad de carotenoides (Granado, 1998). En la separación de TRL se utiliza 1ml de plasma, lo que implica que el volumen de muestra (sangre) tomado a los voluntarios en cada tiempo del periodo postprandial es pequeño. Sin embargo, otros autores defienden el uso de volúmenes de plasma iniciales entre 2 y 5 ml e indican que la utilización de mayores volúmenes puede facilitar el manejo de la muestra (separación de fases, extracción de analitos, reconstitución) y minimizar posibles errores de pérdidas debidos a la manipulación (Van Vliet y cols, 1995; Borel y cols, 1997;1998; Van het Hof y cols, 2000; Park y cols, 2000; Guerci y cols, 2001; Pérez-Martínez y cols, 2004; Faulks y cols, 2004; Jeanes y cols, 2005; Agreen y cols, 2005). En nuestro ensayo quizás la utilización de volúmenes mayores podría haber favorecido la manipulación de la muestra e incluso quizás haber minimizado las interferencias en el valor basal, lo que podría explicar en parte la falta de respuesta observada en el α-tocoferol.

Asimismo, las condiciones de centrifugación descritas para la separación de TRL varían mucho entre estudios utilizándose diversas combinaciones de revoluciones y tiempo; baja velocidad durante más tiempo (12.000-18.000g, 30-120 minutos) (Granado y cols, 1998; Agren y cols, 2005) o viceversa (20.000-150.000g, 15 a 60 minutos) (Van Vliet y cols, 1995; Borel y cols, 1997, 1998; Van het Hof y cols, 2000; Park y cols, 2000; Guerci y cols, 2001; Pérez-Martínez y cols, 2004; Jeanes y cols, 2005), u otras combinaciones (64.000g durante

118 4h) (Faulks y cols, 2004). Así mismo, dado que la ingesta de diferentes alimentos (leche entera o preparado lácteo infantil) da lugar a quilomicrones con diferente composición y tamaño (German y Dillard, 2006), no podemos descartar que los distintos tipos de leche aportados en nuestro estudio, aún manteniendo una desayuno estándar (tabla 3), pudieran haber afectado la separación de las fracciones TRL.

Al comienzo de cada estudio, en sangre basal de los sujetos en ayunas (mínimo 8 h) no hay quilomicrones, por lo que las concentraciones de ésteres de retinilo y de α-tocoferol debería ser teóricamente 0 µg/100ml. En nuestro estudio, la cantidad de vitamina A (en forma de ésteres de retinilo) en las TRL era inferior al límite de cuantificación (0,2µg / 100ml), aunque en el caso de la vitamina E, el α-tocoferol cuantificado fue <300µg/100ml. Una posible explicación para la presencia de α-tocoferol en ayunas en TRL sería la existencia de interferencias con otras fracciones del plasma. El diferente comportamiento entre las dos vitaminas puede radicar en las concentraciones sustancialmente diferentes de ambos compuestos en sangre (palmitato de retinilo, normalmente < 10 µg/dl vs α-tocoferol, 700 - 1800 µg/dl). No obstante, incluso con la utilización de técnicas más sensibles, como es la ultracentrifugación, se ha descrito una separación incompleta de las fracciones VLDL y QM (Cohn, 1997).