Las determinaciones microbiológicas se realizaron siguiendo las metodologías
establecidas por la ICMSF (International Commission on Microbiological
Specifications for Foods, 2000) que a continuación se describen:
DETERMINACION DE AEROBIOS MESOFILOS TOTALES
Método 1: Recuento estándar en placa, recuento en placa por siembra en todo el medio o recuento en placa de microorganismos aerobios.
Material y Aparatos:
1. Los señalados anteriormente para la preparación y dilución de los
homogeneizados de alimentos, Métodos 1, 2 o 3 (Págs. 111-116).
2. Placas de Petri de vidrio (100x15 mm) o de plástico (90x15 mm).
3. Pipetas bacteriológicas de 1, 5 y 10 ml (de idénticas características exigidas
para las diluciones de muestras de leche; Hausler, 1972).
4. Baño de agua o estufa de aire para templar y mantener el medio fundido a 44-
46°C.
5. Estufa de incubación, 29-31°C. (Nota: la constancia y la uniformidad de la
temperatura en las estufas son notoriamente deficientes. Para comprobar el
primer factor, mantenimiento de una temperatura constante, deben realizarse
lecturas continuas o frecuentes de la temperatura interior, durante un periodo
de tiempo de varias horas, utilizando pares térmicos o termómetros adecuados.
Para probar la uniformidad de la temperatura en el interior de la estufa, deben
hacerse lecturas similares, también en un periodo de varias horas y en distintos
92 1972). Al colocar las pilas de placa Petri dentro de la estufa hay que tener
presente que estas deben estar separadas entre sí y también de las paredes y
del techo de la estufa, cada montón o pila debe estar formado como máximo
por seis placas, siendo preferible que su número no sea superior a cuatro.
6. Contador de colonias (se recomienda el modelo Quebec de campo oscuro o
equivalente).
7. Dispositivo de registro automático del número de colonias contadas.
8. Agar para recuento (Agar de los Standars Methods; Medio 92).
Técnica:
1. Preparar la muestra de alimento por uno de los tres procedimientos
recomendados en la sección sobre preparación y dilución de los
homogeneizados alimentos (págs.111-116).
2. Pipetear por duplicado en placa de Petri, alícuotas de 1mL de las diluciones 10-
1, 10-2, 10-3,10-4, y 10-5 y una alícuota de 0.1 mL de la dilución 10-5 lo que supone
la siembra por placa de 10-1 a 10-6 g de alimento. Se aconseja esta serie de
diluciones en aquellos casos en que se desconoce el número aproximado de
gérmenes presentes en el alimento, pero el rango de diluciones preparadas y
sembradas puede modificarse en función de la cifra de microorganismos
esperada. De todos modos, siempre deben sembrarse por lo menos tres
diluciones consecutivas.
3. Fundir el agar para recuento en placa utilizando vapor o agua hirviendo y
93 Templar el medio a 44-46°C y controlar cuidadosamente su temperatura para
que al mezclarlo con la dilución del alimento no sean inactivados los gérmenes.
Verter inmediatamente en las placas Petri 10-15 ml de medio fundido y templado.
El periodo de tiempo transcurrido entre la realización de las diluciones y el
vertido del medio no debe superar los 20 minutos y es preferible que sea inferior
a 10 minutos.
4. Acto seguido, mezclar el inoculo con el medio fundido, inclinando y girando las
placas. La forma adecuada de llevar a cabo esta operación es realizar
movimientos de vaivén 5 veces o girar 5 veces en sentido horario y antihorario.
5. Con el fin de controlar la esterilidad, preparar una o varias placas conteniendo
medio y el diluyente sin inocular. Transcurrido el periodo de incubación el
número de colonias presentes en estas placas no debe modificar el recuento
en más de una unidad en la segunda cifra significativa.
6. Una vez solidificado el agar, invertir las placas e incubarlas a 29-31°C durante
48±3 horas.
7. Calcular el recuento estándar en placa o el recuento estándar en placa
estimado de acuerdo con las directrices recogidas en los apartados 8 y 9. Tener
en consideración todas las instrucciones relativas al cálculo, a los datos que
deben anotarse, a la presencia de inhibidores y de las colonias de crecimiento
difusivo en superficie a los informes e interpretación y a la reproducibilidad y
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DETERMINACION DE MOHOS Y LEVADURAS
Método de recuento de mohos y levaduras por siembra en placa en todo el medio
Material y aparatos:
1. Lo necesario para la preparación y dilución de los homogeneizados de
alimentos (págs. 111-116).
2. Placas de Petri, de vidrio (100x15mm) o de plástico (90x15mm).
3. Pipetas bactereologicas de 1, 5 y 10 ml.
4. Baño de agua o estufa de aire forzado para templar el agar fundido, 44-46°C.
5. Estufa de incubación 20-24°C.
6. Contador de colonias (tipo Quebec de campo oscuro o similar).
7. Dispositivo de recuento con registro automatico.
8. Agar oxitetraciclina gentamicina extracto de levadura glucosa (Medio 79).
Técnica:
1. Preparar la muestra de alimento por uno de los tres procedimientos
recomendados en el capítulo sobre preparación y dilución de los
homogeneizados de alimentos (págs. 111-116). (Importante: procurar que
transcurra el menor tiempo posible para evitar el crecimiento o la muerte de los
microorganismos suspendidos en el diluyente).
2. Pipetear por duplicado en placa Petri, alícuotas de 1mL de las diluciones -1, -
95 por placa de -1 a -6 g de alimento. Siempre deben sembrarse por lo menos tres
diluciones consecutivas.
3. Rápidamente verter en las placas Petri 10-15 ml de medio agar oxitetraciclina
gentamicina extracto de levadura glucosa fundido y templado a 44-46°C.
4. Mezclar inmediatamente el inoculo con el agar balanceando la placa de
izquierda a derecha cinco veces, rotándola en el sentido de las agujas del reloj
otras cinco veces el movimiento de vaivén en sentido perpendicular al primero
y rotándola finalmente cinco veces en sentido contrario a las agujas del reloj.
5. Una vez solidificado el agar, invertir las placas e incubarlas a 20-24°C durante
3-5 días.
6. Con ayuda del contador de colonias y del dispositivo de recuento con registro
automático, contar las colonias en aquellas placas que contengan entre 30 y
300, llevando a cabo un examen microscópico cuando sea necesario para
identificar las colonias de levaduras.
7. Calcular el número de mohos y levaduras por gramo de alimento.
DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES: TECNICA DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP)
Material y Aparatos:
1. Los señalados anteriormente para la preparación y dilución de los
homogeneizados de alimentos, Métodos 1, 2 o 3 (Págs. 111-116).
2. Estufa de incubación, 35-37°C.
96 4. Asa de inoculación, con alambre de nicrom o de platino-iridio.
5. Caldo lactosa bilis (2%) verde brillante (Medio 17), volúmenes de 10 ml en tubos
de 150x15 mm, conteniendo tubos de fermentación de Durham invertidos o
viales similares de vidrio (75x10mm).
Técnica:
1. Preparar la muestra de alimento por uno de los tres procedimientos
recomendados en la sección sobre preparación y dilución de los
homogeneizados alimentos (págs.111-116). Para hacer las diluciones pueden
utilizarse los blancos de dilución o frascos de diluyentes sobrantes del método
de recuento en placa.
(Importante: una vez hechas las diluciones del alimento, debe procurarse que
transcurra el menor tiempo posible hasta que se realizan las siembras, pues así
se evitan la multiplicación o la muerte de los microorganismos suspendidos en
el diluyente).
2. Pipetear 1 ml de cada una de las diluciones del homogenizado del alimento en
tubos de Caldo Lauril Sulfato Triptosa, utilizando tres tubos por cada dilución.
3. Incubar los tubos a 35-37°C durante 24-48 horas.
4. Pasadas las primeras 24 horas anotar los tubos que muestren producción de
gas. Volver a la estufa los tubos negativos para su incubación por 24 horas
más.
5. Pasadas las 48 horas, anotar los tubos que muestren producción de gas.
6. Elegir la dilución más alta en la que sean positivos de formación de gas los tres
97 más alta en la que aparecen los tres tubos positivos es la 1:100 y en la 1:1000
hay un tubo positivo y en la 1:10000 ninguno, el resultado se anotaría del
siguiente modo: dilución 1:100=3, dilucion1:1000=1 y dilución 1:10000=0. Estos
resultados corresponden en la tabla del NMP para series de tres tubos a un
NMP de 400.
Si no hubiera ninguna dilución que presentase los tres tubos positivos,
seleccionar las tres diluciones más altas con algún tubo positivo. Por ejemplo
si las cuatro últimas diluciones con algún tubo positivo fueran 1:10, 1:100,
1:1000 y 1:10000 con 2,2,1 y 1 tubos positivos, respectivamente, los resultados
se anotan 1:100=2, 1:1000=1 y 1:10000=1 este resultado corresponde en la
tabla del NMP a 200.
7. Confirmar que los tubos de caldo lauril sulfato triptosa seleccionadas
anteriormente son positivos, transfiriendo una asa de cada tubo a otro tubo con
caldo lactosa bilis 2% verde brillante (conteniendo campanas de fermentación).
Incubar los tubos de confirmación durante 24-48 horas a 35-37°C y observar la
producción de gas. La formación de gas confirma la presencia de organismos
coliformes.
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