4.2.1.4 Microextracción en fase sólida (SPME)

La SPME se ha aplicado en pocas ocasiones a la determinación de estrógenos. Braun y col.[43] han determinado 17-α-etinilestradiol en muestras de agua utilizando SPME en combinación con GC-MS, para lo que emplean una fibra de poliacrilato y un tiempo de extracción de una hora. El límite de detección que obtienen es de 40 ng/L, insuficiente para el análisis de muestras reales. Okeyo y col.[44, 45] proponen la derivatización on-fiber para determinar estrona y 17-_β-estradiol en muestras clínicas (orina y suero) y muestras de agua mediante GC-MS. Para ello, exponen una fibra de PA durante 30 minutos a la muestra y a continuación, llevan a cabo la derivatización situando la fibra de PA en el espacio de cabeza de un vial que contiene 5 _µL de BSTFA. La derivatización tiene lugar durante una hora a 70 ºC. Estiman unos límites de detección en torno a 40 ng/L para muestras clínicas. No obstante, no evalúan de manera sistemática los límites de detección para muestras de agua residual o agua superficial.

Peñalver y col. [46] han utilizado la SPME en combinación con HPLC para la determinación de estrógenos en muestras de agua. La concentración de los analitos se realizó durante 45 minutos a 65 ºC con una fibra de PA. Utilizando detección electroquímica alcanzaron límites de detección entre 60 y 80 ng/L.

4.2.2. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA

Las formas conjugadas de los estrógenos: glucurónidos y sulfatos, poseen menor actividad estrogénica que las libres. No obstante, pueden convertirse con relativa facilidad en las formas libres, sobre todo durante los procesos de tratamiento de aguas residuales[28].

Mediante cromatografía de gases sólo es posible medir la concentración de las formas libres de los estrógenos. Para poder determinar su concentración total es preciso introducir una etapa de hidrólisis en el proceso de preparación de la muestra. Las concentraciones de las hormonas conjugadas se determinan por diferencia entre los resultados obtenidos para la muestra

88 ESTRÓGENOS hidrolizada y la no hidrolizada. La enzima glucuronidasa ha sido utilizada para llevar a cabo la hidrólisis de las formas conjugadas (glucurónidos y sulfatos)[7, 47, 48, 49]_{. Esta enzima convierte}

cuantitativamente el glucurónido del 17-β-estradiol a su forma libre, pero sólo aproximadamente un 30 % del conjugado sulfato pasa a la forma libre, por lo que la concentración de esta última forma puede ser infraestimada[50].

4.2.3. DERIVATIZACIÓN

En la determinación de estrógenos mediante cromatografía de gases se suele recurrir a una etapa de derivatización para mejorar la estabilidad de los compuestos, así como la sensibilidad y precisión del análisis. Utilizando cromatografía líquida la derivatización no es necesaria. No obstante, podemos encontrar en la bibliografía algún trabajo en el cual los estrógenos se hacen reaccionar con un quelato de europio, para dar lugar a derivados fluorescentes, que se determinan mediante HPLC con detección fluorimétrica[30].

En cuanto a la determinación de estrógenos mediante GC, las reacciones de derivatización más utilizadas son las siguientes:

1) Sililación. Esta reacción consiste en la sustitución de un hidrógeno activo de un grupo funcional hidroxilo por un átomo de silicio trisustituido, figura 4.2.1. El proceso debe llevarse a cabo en condiciones anhidras, ya que los derivados sililados se caracterizan por descomponerse en presencia de trazas de agua. Normalmente, se realiza poniendo en contacto el extracto orgánico, obtenido una vez concentrada la muestra, con un determinado volumen de agente derivatizante. La reacción tiene lugar a temperatura elevada y generalmente, no es preciso eliminar los subproductos antes de analizar la mezcla mediante cromatografía de gases.

ESTRÓGENOS 89 R OH CF₃ N O Si(CH3)3 Si(CH₃)₃

+

+

Figura 4.2.1. Reacción de derivatización con bis(trimetilsilsil)trifluoroacetamida (BSTFA).

Los reactivos sililantes, figura 4.2.2, más empleados para la derivatización de los grupos hidroxilos de los estrógenos son:

N-metil-N-(tert-butildimetilsilil)trifluoroacetamida (MTBSTFA), solo[15] o conteniendo un 1 % de tert-butildimetilclorosilano (TBDMCS) como catalizador[29]. Este agente derivatizante no es capaz de reaccionar con los grupos hidroxilos alifáticos.

CF3 N O Si(CH3)3 Si(CH₃)₃ b) a) CF3 N O CH₃ Si CH₃ CH₃ c) CF3 N O CH₃ Si CH₃ CH₃ CH₃ e) Si CH₃ CH₃ CH₃ Cl d) _Si CH₃ CH₃ Cl f) Si _CH 3 CH₃ CH₃ N N

Figura 4.2.2. Agentes sililantes: a) N-metil-N-(tert-butildimetilsilil)trifluoroacetamida,

b) Bis(trimetilsilsil)trifluoroacetamida, c) N-metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetamida. Catalizadores: d) tert-butildimetilclorosilano, e) trimetilsililclorosilano, f) trimetilsililimidazol.

Bis-(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA), solo[44, 45] o acompañado de trimetilclorosilano (TMCS) como catalizador[37]. Es un agente derivatizante

90 ESTRÓGENOS menos voluminoso que el MTBSTFA, por lo que es capaz de reaccionar con grupos hidroxilos con un mayor impedimento estérico.

N-metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetamida (MSTFA)[38], generalmente combinado con pequeñas cantidades de trimetilsililimidazol (TMSI) y ditioeritrol (DTE), como catalizadores de la reacción[18, 40, 51, 52].

2) Formación de derivados perfluorados. Este tipo de reacción origina derivados capaces de captar electrones, por lo que su determinación se lleva a cabo mediante cromatografía de gases acoplada a un detector de captura electrónica o a espectrometría de masas con ionización química negativa (NCI). El reactivo más utilizado es el bromuro[27] o cloruro[9,

34] _{de pentafluorobencilo (PFBBr o PFBCl). Este compuesto sólo es capaz de derivatizar}

los -OH aromáticos, figura 4.2.3. Por ello, Nakamura y col.[8] utilizaron una derivatización mixta con PFBBr y TMSI, para derivatizar tanto los OH aromáticos como los alifáticos de los estrógenos. Mientras que Croley y col.[53]_{, propusieron la}

derivatización con anhídrido pentafluoropropiónico, consiguiendo la derivatización de los -OH aromáticos y alifáticos, salvo en el caso del mestranol y del 17-α-etinilestradiol. Por otro lado, Lerch y Zinn[54] han evaluado la reactividad de 8 agentes derivatizantes perfluorados con estrógenos. Llegan a la conclusión de que los mejores derivados perfluorados, en cuanto a su estabilidad y características cromatográficas, son los obtenidos con el anhídrido heptafluorobutírico y el anhídrido trifluoroacético. No obstante, ninguno de estos compuestos es capaz de reaccionar con los grupos hidroxilo alifáticos del mestranol y del 17-α-etinilestradiol, debido al impedimento estérico del grupo etinilo. F F F F F CH₂Br + + HBr R OH R O F F F F F C H₂

ESTRÓGENOS 91