Microsatélites

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reflejados los “Descriptores para la Evaluación”, de menor importancia, los cuales incluían a los microsatélites entre los marcadores moleculares. La situación hoy en día, diez años más tarde, ha cambiado considerablemente: muchos institutos de la vid utilizan los microsatélites como marcadores para identificar sus variedades, además de, o en vez de, las descripciones morfológicas. La OIV acaba de incorporarlos a su sistema como descriptores para la caracterización.

1.2.4.1.1. Características de los microsatélites

Los microsatélites consisten en una pequeña unidad de repetición, generalmente de menos de 4 nucleótidos, que puede estar repetida un número variable de veces en distintos puntos del genoma, normalmente con longitudes menores de 100 pb cada locus. También se llaman por ello repeticiones de secuencias simples (SSR). Desde su descubrimiento se intuyó la utilidad que estas secuencias podían tener como marcadores polimórficos (Tautz, 1989).

En Thomas y Scott (1993), se demostró que las secuencias repetidas presentes en el genoma de la vid (microsatélites, minisatélites, genes en tándem y secuencias altamente repetidas), son especialmente útiles para la identificación de cultivares de esta especie. Cabe destacar que, como otros eucariotas, el genoma de la vid es rico en secuencias microsatélites. En concreto observaron que las repeticiones de dinucleótidos (GA) y (GT) eran muy comunes y aparecían dispersas en el genoma, frente a repeticiones de tri o tetranucleótidos (CAC, GACA, GATA), que estaban en menor proporción.

Los microsatélites son muy útiles como marcadores genéticos cuando se utilizan como “Sitios Marcados por Secuencia o STS”, denominados en este caso particular STMS “Sequence-Tagged Microsatellite Site”. Para su análisis, es necesario determinar previamente las secuencias que flanquean a la repetición. A partir de las mismas se pueden diseñar cebadores específicos para cada locus, y obtener así por amplificación mediante PCR los distintos alelos para cada locus microsatélite particular. Si hay variación de un individuo a otro en el número de veces que la unidad está repetida, se observará una diferencia entre ambos en el tamaño del fragmento amplificado. Dado que la vid es diploide, se obtienen normalmente dos fragmentos amplificados (dos alelos) para cada individuo por locus, excepto en los homocigotos. De esta manera se puede establecer, para cada STMS, la composición alélica de cada variedad.

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El polimorfismo se genera por un mayor o menor número de repeticiones de la unidad básica. Se han propuesto dos mecanismos para explicar cómo se generan las diferencias en longitud de los distintos alelos: el deslizamiento de las hebras complementarias de ADN durante la replicación del mismo (Levinson y Gutman, 1987), y errores durante el sobrecruzamiento en la meiosis, ambos sucesos pueden co-existir en la misma variedad y en el mismo locus (Riaz et al., 2002). Probablemente ambos contribuyen a la creación de variabilidad en los microsatélites (Ortiz, 1998), aunque el primero parece ser predominante (Wolff et al., 1989).

Además de estas mutaciones producidas por el aumento o disminución de repeticiones de la unidad básica, hay que tener en cuenta las mutaciones que producen alelos nulos (Regner et al., 2000b), (Crespan et al., 1999), (Bowers et al., 1996), (Sanchez-Escribano et al., 1999) etc. Los alelos nulos aparecen al producirse modificaciones en la secuencia diana de los cebadores, impidiendo la hibridación con el ADN molde. Por lo tanto, esas regiones no son amplificadas, con lo que no pueden ser observadas en el análisis. Este tipo de polimorfismo no es deseable, pues no es posible distinguir entre individuos heterocigóticos con un alelo nulo de los homocigóticos, y además, diferentes alelos nulos dan lugar al mismo fenotipo (ausencia de fragmento amplificado).

Los STMS tienen numerosas ventajas frente a otros tipos de marcadores moleculares:

• Polimorfismo muy elevado

• Análisis rápido y escrutinio de alelos fácil y objetivo

• Reproducibilidad muy alta

• Resultados transferibles entre laboratorios

• Herencia mendeliana codominante y por ello permiten análisis de genealogías

• No están influidos por el ambiente

Sin embargo, tienen el inconveniente de requerir el conocimiento previo de las secuencias flanqueantes de los loci microsatélite para poder diseñar los cebadores específicos. Naturalmente esto no es necesario si, como es el caso de la vid, ya se cuenta con un número suficiente de loci microsatélite descritos y

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actualidad. La altísima variabilidad de los STMS hace que sean necesarios muy pocos para estudios de identificación.

1.2.4.1.2. Uso de los STMS para caracterización de vid

Para el análisis de la vid, los microsatélites fueron descritos por primera vez por Thomas y Scott (1993). Describieron 5 microsatélites y las secuencias necesarias para su amplificación mediante PCR (VVS1, VVS2, VVS3, VVS4 y VVS5). Estos cebadores, cuyas secuencias se obtuvieron de Vitis vinifera L. cv Sultana, amplificaban además de en esta especie en otras del mismo género, así como en híbridos interespecíficos. Con estos 5 STMS distinguieron 26 cultivares de vinífera y demostraron su utilidad para confirmar o rechazar genealogías en vid. En una publicación posterior, Thomas et al. (1994) incluyeron otros dos microsatélites más: VVS19 y VVS29, y una propuesta de metodología universal para la construcción de una base de datos global de vid. Esta metodología incorporaba un análisis semiautomático de los fragmentos amplificados, merced a su marcaje con un fluorocromo. La determinación del tamaño de los fragmentos se realizaría de forma automática con un programa informático GeneScan, de Perkin Elmer. De esta forma se empezaron a aplicar los STMS para analizar variedades de vid, (Cipriani et al., 1994), (Botta et al., 1995). Con posterioridad se desarrollaron nuevos marcadores STMS de Vitis vinifera: VVMD5, VVMD6, VVMD7 y VVMD8 (Bowers y Meredith, 1996), obtenidos de la variedad Pinot noir. Hasta la actualidad se han publicado un gran número de trabajos en los que se han utilizado los STMS para caracterizar variedades de vid (Meredith et al., 1996), (Ibáñez, 1998), (Sefc et al., 1999), (Ibáñez et al., 2003), (Merdinoglu et al., 2005). Actualmente, en el NCBI se cuenta con más de 360 loci microsatélite de libre disposición (This et al., 2006), además de otros que se han obtenido pero son de uso restringido para los miembros de un Consorcio Internacional de Vid.

La utilidad de los STMS para distinguir variedades de vid es muy elevada, dada la cantidad de alelos existentes por loci y por ello, la improbabilidad de que dos variedades diferentes compartan los mismos alelos en todos sus loci. La técnica permite detectar las sinonimias y los problemas de identificación tan habituales en vides cultivadas. Los STMS también se han utilizado en estudios de similitud intervarietal en vid (Sefc et al., 1998), (Maletic et al., 1999), (Lopes et al., 1999), (Sefc et al., 2000).

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Muchos grupos de investigación han desarrollado sus propios marcadores microsatélites, pero el principal intento internacional para armonizar un sistema basado en microsatélites para la identificación de variedades de vid fue llevado a cabo dentro de un proyecto de la Unión Europea (GENRES081). Los 10 laboratorios que colaboraron en el proyecto, entre los cuales se encontraba el laboratorio de Biología Molecular de la Finca El Encín (IMIDRA), representaban las mayores colecciones de vid europeas, persiguiendo como objetivo el desarrollo de una base de datos central europea que contuviera entre otros datos, alelos de referencia microsatélite para la identificación de accesiones de vid (This et al., 2004). Sin embargo, para que la base de datos resultara útil a diferentes laboratorios que emplearan diferentes equipos y métodos, los alelos debían ser estandarizados, como ya se había demostrado previamente para tomate (Bredemeijer et al., 2002) y para trigo (Röder et al., 2002). Seis microsatélites informativos fueron seleccionados: VVS2, VVMD5, VVMD7, VVMD27, ssrVrZAG62 y ssrVrZAG79. Todos los participantes analizaron idénticas muestras de DNA (ring test), pertenecientes, siempre que fue posible, a variedades de vid bien conocidas y ampliamente distribuidas geográficamente, con el fin de que el trabajo tuviera la mayor utilidad posible dentro de la comunidad científica. Para cada alelo de cada locus microsatélite, se seleccionó una variedad de las que lo presentaban, que serviría de referencia para todos los laboratorios implicados, y ello permitiría el desarrollo de una base de datos común e internacional. Con los resultados obtenidos, se elaboraron descriptores para los 6 loci microsatélite estudiados.

Desafortunadamente, al comienzo de ese proyecto no había información de la posición en los mapas de los microsatélites, y entre los 6 microsatélites elegidos, cuatro de ellos estaban ligados genéticamente 2 a 2. Por esa razón, y porque no son capaces de discriminar todas las variedades diferentes (no “sports”) (Martín et al., 2003), ese set de 6 microsatélites no supone una optima selección. Por ello se hace necesario proponer otro conjunto de microsatélites más adecuado para llevar a cabo la caracterización de variedades de vid.

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In document Estudio de un sistema de marcadores microsatélites para la protección y defensa legal de variedades de vid ("Vitis vinifera L ") (página 35-40)