Las Figuras 10 y 11 muestran los resultados obtenidos de las microscopías óptica y MCEL, y de la reconstrucción en 3D del biofilm de C. albicans y C. tropicalis, bajo las condiciones ensayadas, respectivamente. De acuerdo con los resultados obtenidos en el experimento de microtécnica con CV para la cepa C. albicans se evaluó el biofilm no tratado (CC), las NP Ag (13,5 nM), AmB (50 µg/ml) y la combinación de las NP Ag con AmB.
C. albicans
MCEL A)Microscopía óptica,
campo brillante
B) Vista del plano XY y ortogonal
C) Reconstrucción 3D
44 A)Microscopía óptica,
campo brillante
B) Vista del plano XY y ortogonal
C) Reconstrucción 3D
Figura 10. Estructura de los biofilms de C. albicans SC5314 teñidos con Calcofluor White visto en campo brillante y MCEL. A) corresponde a las imágenes obtenidas por microscopía óptica de campo brillante (60x). B) muestra imágenes obtenidas por MCEL que corresponden con la proyección sobre el eje Z del plano XY y la vista
NP Ag 13,5 nM AmB 50 µ g/m l NP Ag + AmB
45 ortogonal. C) se presentan las reconstrucciones en 3D, de cada condición: CC, NP Ag 13,5 nM, AmB 50 µg/ml y NP Ag + AmB.
La condición CC mostró que la biomasa del biofilm cubrió toda la superficie. Se pudo visualizar un biofilm denso, con presencia de abundante matriz de EPS, donde el espesor fue característico del biofilm. Por otro lado, cuando se analizaron los biofilms tratados con AmB, NP Ag y la combinación, se observaron una disminución tanto de la biomasa como también del espesor del biofilm y ausencia de EPS. También se encontró una gran diferencia en la superficie cubierta y en agrupación celular que presentó el biofilm no tratado con respecto a los tratados. Sin embargo, cuando se focalizó en la comparación de los efectos de las tres condiciones de los tratamientos en la combinación se observó ausencia de macrocolonias.
Para la cepa C. tropicalis se evaluó el biofilm no tratado (CC), el compuesto AU (2,5 µg/ml), las NP Ag (13,5 nM), AmB (50 µg/ml) y las combinaciones AU+NP Ag y NP+AmB (Figura 11).
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C. tropicalis
MCEL
A)Microscopía óptica, campo brillante
B) Vista del plano XY y ortogonal C) Reconstrucción 3D CC AU 2,5 µ g/m l NP Ag 13,5 nM
47 A)Microscopía óptica,
campo brillante
B) Vista del plano XY y ortogonal
C) Reconstrucción 3D
Figura 11. Estructura de los biofilms de C. tropicalis SC5314 teñidos con Calcofluor White visto en campo brillante y MCEL. A) corresponde a las imágenes obtenidas por microscopía óptica (60x), campo brillante; B) muestra imágenes obtenidas por MCEL que corresponden con la proyección sobre el eje Z del plano XY y la vista ortogonal, C) se presentan las reconstrucciones en 3D, de cada condición: CC, AU 2,5 µg/ml, NP Ag 13,5 nM, AmB 50 µg/ml, AU+NP Ag y NP Ag+AmB.
Np A g + AmB AU + NP Ag AmB 50 µ g/m l
48 En las imágenes de la Figura 11, la reconstrucción en 3D permitió visualizar que para la condición CC la biomasa del biofilm formado ocupó toda la superficie y el espesor constituyó varias capas de células. En las condiciones AU (2,5 µg/ml) y NP Ag (13,5 nM) la superficie que ocupó la biomasa del biofilm fue similar y también lo fue si comparamos estas condiciones con el CC; sin embargo, el espesor disminuyó marcadamente. En la condición AmB (50 µg/ml) se observó una diminución marcada de la biomasa y del espesor. El efecto de las combinaciones de los compuestos (AU+NP Ag y NP Ag+AmB) tuvo una acentuada disminución en la biomasa y el espesor del biofilm, que se denotó aún más en la combinación NP Ag+AmB. En las condiciones en las que están implicadas las NP Ag se observó, a través de las diferentes microscopías, una gran producción de hifas. Nuevamente se correspondieron las imágenes obtenidas por las diferentes técnicas microscópicas con la reconstrucción 3D en las condiciones experimentadas.
Posterior al procesamiento de imágenes y la reconstrucción en 3D del biofilm se cuantificó IF dada por Calcofluor White de cada una de las condiciones experimentadas. Las condiciones ensayadas mostraron las siguientes IF: para las NP Ag fue de 24,30 ± 3,34, para AmB fue de 28,88 ± 0,59 y para la combinación NP Ag+AmB fue de 85,45 ± 12,23. Estos resultados fueron significativamente diferentes comparados con el biofilm no tratado (*p<0,05). Esto mostró que la IF se correspondió con los resultados obtenidos en el ensayo de combinaciones de ATF medidos por microtécnica con CV, es decir, se observó la misma tendencia de reducción. La Figura 12 muestra los resultados de IF obtenidos para C. albicans.
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Figura 12. Cuantificación de IF en los biofilms de C. albicans SC5314. Condiciones CC, NP Ag 13,5 nM, AmB 50 µg/ml y, la combinación de NP Ag y AmB.CC: control crecimiento. Las barras de error representan el desvío estándar, * corresponde al p<0,05 de las condiciones experimentadas comparadas con el CC.
Para la cepa C. tropicalis se encontró que AU mostró una IF de 135,25 ± 50,24 y para las NP Ag fue de 201,80 ± 31,27, ambos resultados fueron significativamente diferentes comparados con el biofilm no tratado (*p<0,05). En este caso, los colorantes utilizados para la formación del biofilm por microtécnica CV y el utilizado en la MCEL (Calcofluor White) para la evaluación de la arquitectura del biofilm, no mostraron correspondencia, probablemente debido a la naturaleza de la matriz de EPS de C. tropicalis y por la característica de ser una cepa altamente formadora de biofilm. La IF producida por la acción antibiofilm de AmB fue de 65,71 ± 2,94, el de la combinación AU+NP Ag fue de 61,06 ± 0,54 y el de la combinación NP Ag+AmB fue de 20,08 ± 2,35. Estos resultados fueron diferentes significativamente con respecto a los demás tratamientos (*p<0,05, #p<0,05). La figura 13 muestra la IF que se obtuvo para la cepa
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Figura 13. Cuantificación de IF en los biofilms de C. tropicalis NCPF 3111 de las condiciones CC; AU 2,5 µg/ml; NP Ag 13,5 nM; AmB 50 µg/ml y; las combinaciones de AU y NP Ag y; NP Ag y AmB. CC: control crecimiento. Las barras de error representan el desvío estándar, * corresponde al p<0,05 entre los tratamientos y el CC, y # corresponde al p<0,05 entre los tratamientos.
Para el análisis de resultados obtenidos en la cuantificación de IF, se considera que se obtuvo un efecto similar en cuanto a la reducción del biofilm, comparado con el efecto obtenido en la microtécnica con CV. Es decir que, se observó el mismo comportamiento de erradicación dadas por las combinaciones ensayadas para la microtécnica con CV e IF.
A partir de las imágenes de MCEL y a través del software COMSTAT, se obtuvieron los parámetros cuantitativos de: biomasa (µm3/µm2), espesor promedio (µm), Ra* y distancia de difusión (µm). El CC (biofilm no tratado) de C. albicans
mostró los siguientes resultados de biomasa: 16,77 ± 5,45 µm3/µm2; el espesor promedio: 18,16 ± 5,33 µm; el Ra*: 0,09 ± 0,04 y la distancia de difusión: 1,21 ± 0,96 µm.
Las NP Ag presentaron una biomasa de 5,45 ± 1,97 µm3/ µm2, el espesor promedio fue de 5,72 ± 2,10 y el Ra* fue de 1,21 ± 0,15, estos resultados fueron diferentes estadísticamente con respecto al biofilm no tratado (*p<0,05). Para el tratamiento con AmB se obtuvo una biomasa de 4,51 ± 2,21 µm 3/ µm2, el espesor promedio fue de 4,97 ± 2,53 µm y el Ra* fue de 1,17 ± 0,26, resultando
51 significativamente diferentes comparados con el biofilm no tratado (*p<0,05). En relación al tratamiento de combinación NP Ag+AmB se obtuvo una biomasa de 3,80 ± 0,27 µm3/ µm2, el espesor promedio fue de 3,82 ± 0,40 µm y el Ra* fue de 1,35 ± 0,09, y se encontraron diferencias significativas (*p<0,05). En cuanto al parámetro distancia de difusión no se mostraron diferencias estadísticas. Estos resultados dados por el análisis COMSTAT se muestran en la figura 14.
Figura 14. Estudio del efecto ATF de los compuestos NP Ag 13,5 nM, AmB 50 µg/ml y de la combinación de NP Ag y AmB en los biofilms de C. albicans SC5314 por análisis COMSTAT. CC: Control de crecimiento. Las barras de error representan el desvío estándar, * indica diferencias significativas con respecto al CC con un p<0,05.
Analizando el parámetro de biomasa y en comparación con el CC, se determinó una reducción 67%, 73% y 77% en las condiciones NP Ag, AmB y NP Ag+AmB, respectivamente. El espesor promedio del biofilm disminuyó un 68% para AmB y las NP Ag, y un 79% para la combinación. En cuanto al Ra*, presenta un aumento significativo con respecto al CC en las tres condiciones ensayadas. Esto se debe a la acción de los compuestos sobre el espesor promedio de los biofilms, porque al disminuir este parámetro resultó en un aumento de la rugosidad y por lo tanto en un
52 aumento en el Ra*. En el parámetro distancia de difusión, se observó una disminución en los tratamientos comparados con el CC. Sin embargo, no mostró diferencias significativas. Mediante el análisis de los parámetros cuantitativos se muestra que el tratamiento con AmB, NP Ag y NP Ag+AmB afecta la arquitectura del biofilm de C. albicans. Además, estos resultados concuerdan con lo encontrado en el experimento de microtécnica con CV, así como con los resultados arrojados por la cuantificación de la IF.
Por otra parte, el CC de la cepa C. tropicalis mostró una biomasa de 22,42 ± 5,78 µm3/µm2, el espesor promedio fue de 23,08 ± 5,23 µm, el Ra* fue de 0,08 ± 0,01 y la distancia de difusión fue de 1,91 ± 0,09 µm. El tratamiento con AmB presentó una biomasa de 5,32 ± 1,30 µm3/µm2, el espesor promedio fue de 6,58 ± 0,75 µm y el Ra* fue de 1,25 ± 0,15; estos resultados fueron significativos (*p<0,05). Para la combinación AU+NP Ag se obtuvo una biomasa de 3,50 ± 1,32 µm3/µm2, el espesor promedio fue de 3,64 ± 1,49 µm y el Ra* fue de 1,43 ± 0,52, siendo diferentes estadísticamente con respecto al CC (*p<0,05). En el tratamiento de combinación NP Ag+AmB la biomasa fue de 1,44 ± 0,41 µm3/µm2, se obtuvo un espesor promedio de 1,50 ± 0,46 µm y el Ra* fue de 1,76 ± 0,06, resultando significativamente diferentes con respecto al control y los demás tratamientos (*p<0,05, #p<0,05). En relación al parámetro distancia de difusión se observó una disminución con respecto al CC; no obstante, no se encontraron diferencias estadísticas. En la Figura 15 se muestra los parámetros cuantitativos del biofilm de C. tropicalis.
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Figura 15. Estudio del efecto ATF de los compuestos AU 2,5 µg/ml, NP Ag 13,5 nM, AmB 50 µg/ml y de las combinaciones de AU y NP Ag y, NP Ag y AmB en los biofilms de C. tropicalis NCPF 3111 por análisis COMSTAT. CC: Control de crecimiento, las barras de error representan el desvío estándar, *indica diferencias significativas con respecto al CC p<0,05 y # corresponde al p<0,05 entre los tratamientos.
Las reducciones calculadas dadas por las condiciones ensayadas que se muestran en los parámetros biomasa y espesor fueron similares, para AmB 76% y 72%, respectivamente, AU+NP Ag 84% tanto en biomasa como en espesor y para la combinación NP Ag+AmB se obtuvo una reducción del 94% en los dos parámetros, siendo el tratamiento más efectivo. El Ra* aumentó significativamente en las condiciones ensayadas con respecto al control. Esto ocurre dado que el Ra* se relacionó inversamente con el espesor mostrado por el biofilm, como se explicó para la cepa C. albicans. En este caso de cuantificación de los parámetros por COMSTAT se considera que las tendencias de reducción fueron similares con respecto a los ensayos de microtécnica con CV e IF.
Por último, los datos arrojados por este programa permitieron comparar la arquitectura de los biofilms no tratados entre las cepas de este estudio. C. tropicalis
54 cada biofilm, fue mayor en C. tropicalis. Por otro lado, C. albicans presentómayor Ra* que C. tropicalis y con respecto la distancia de difusión que se obtuvo en C. tropicalis
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