relacionats amb els fenotips de sensibilitat del mutant ptc
2.4 Mkk1 és la principal MAPKK responsable de l’increment de la senyalització de la via de CWI observat en el mutant ptc
Degut que Mkk1 és un element de la via CWI i que aquesta es troba hiperactivada en un mutant ptc1, vam creure rellevant analitzar l’efecte de la supressió de les MAPKK Mkk1 i Mkk2 en l’activació de la via Slt2 i la transmissió de la senyal d’aquesta quinasa en cèl·lules que els manca la fosfatasa Ptc1. Així doncs vam procedir a analitzar l’activitat transcripcional del promotor del gen MLP1, l’expressió del qual és induïda degut a l’activació de la via Slt2. En un mutant ptc1, on la via Slt2 es troba hiperactivada, l’activitat d’aquest promotor es veu incrementada en comparació amb l’activitat d’aquest promotor en una soca salvatge (González et al. 2006). Tal i com s’observa a la Figura 45, la supressió del gen MKK1 en un mutant ptc1 promou la normalització de l’activitat del promotor de MLP1 disminuint-lo als nivells d’una soca salvatge. Per contra, encara que l’eliminació de MKK2 produeix una disminució de l’activitat del promotor de MLP1 no és capaç de restablir-la als nivells normals. Aquests resultats indiquen que la hiperactivació de Slt2 en absència de Ptc1 depèn essencialment de la funció de la MAPKK Mkk1.
Figura 45. La supressió de MKK1 però no la de MKK2 normalitza l’expressió del promotor MLP1 en mutant ptc1. Les soques indicades es van transformar amb el plasmidi reporter pMLP1 que porta el promotor d’aquest gen fusionat amb el lacZ i es determinar l’activitat β-galactosidasa. Els resultats són la mitjana ± SEM de 6 a 11 experiments.
Després d’observar una reducció de la transmissió del senyal de la via CWI en el doble mutant ptc1 mkk1 vam creure convenient determinar si aquest fet estava relacionat amb una reducció de l’estat de fosforilació de Slt2. D’aquesta forma vam estudiar l’estat de fosforilació d’un mutant ptc1 quan se li suprimia les MAPKK Mkk1 o Mkk2 per western blot i emprant anticossos específics per la detecció de la fosforilació dels residus Thr i Tyr que es troben
A ct ivi ta t β -ga la ct o si d as a WT ptc1 mkk1 mkk2 mkk2 ptc1 mkk1 ptc1 pMLP1 0 20 40 60 80 100 120
RESULTATS I DISCUSSIÓ
126
situats al loop d’activació. Tal i com s’observa a la Figura 46, la pèrdua de MKK1 en un mutant
ptc1 provoca una forta reducció de Slt2 fosforilat així com una disminució dels nivells de Slt2 totals comparat amb els d’una soca ptc1Δ. Per contra, encara que en el doble mutant mkk2 ptc1 es detecta una menor quantitat tant de Slt2 fosforilat com total en comparació amb els nivells de Slt2 de la soca ptc1∆, el nivell de fosforilació de Slt2 és encara prou significatiu i suggereix que la via es troba hiperactivada.
Figura 46. La mutació de MKK1 però no la de MKK2 normalitza la hiperfosforilació de Slt2 en el mutant
ptc1. La quantitat de Slt2 fosforilada (P-Slt2) i total presents a les soques indicades es va determinar per
western blot. El carril de la dreta serveix com a control i correspon al mutant slt2 que no conté el gen de la quinasa. A sota es mostra la tinció de les membranes amb el colorant Ponceau a fi d’assegurar que tots els carrils contenen quantitats similars d’extracte proteic total.
Amb l’objectiu de validar la implicació de Mkk1 en la hiperfosforilació de la proteïna Slt2 observada en el mutant ptc1 es va analitzar l’estat de fosforilació de Slt2 en les soques salvatge, ptc1∆, mkk1∆ i mkk1 ptc1∆ emprant tècniques d’espectrometria de masses. Així doncs, aquestes soques es van transformar amb un plasmidi que expressa una versió de la proteïna Slt2 fusionada a la proteïna GST. Els cultius incubats es van tractar a pH alcalí (8.2) durant 10 minuts just abans de recol·lectar les cèl·lules ja que aquest estrès provoca una activació de la via CWI induint la ràpida fosforilació de la MAPK (Serrano et al. 2006). Tot seguit es va purificar GST-Slt2 per cromatografia d’afinitat de glutatió-agarosa, les mostres es van separar en un gel SDS-PAGE el qual va ser posteriorment tenyit per identificar les bandes proteiques. Un cop detectada la banda que corresponia a la fusió GST-Slt2 es va retallar i es va procedir a la digestió de la proteïna per tripsina. Després d’enriquir les mostres en fosfopèptids es van analitzar per espectrometria de masses. Amb aquesta tècnica es va identificar un únic pèptid fosforilat que correspon al que conté els residus fosforilables Thr i Tyr situats al loop d’activació. Cal destacar que era d’esperar obtenir aquest pèptid ja que la
RESULTATS I DISCUSSIÓ
127 fosforilació d’aquests residus és la que es detecta per western blot. A partir de les dades obtingudes es va calcular la relació entre el pèptid fosforilat i els pèptids totals. Els nostres resultats indiquen que els nivells de fosforilació d’aquest pèptid és 5.6 vegades més elevat en el mutant ptc1 en comparació als de les cèl·lules mkk1∆ i que la supressió de la MAPKK MKK1 a la soca ptc1∆ mostra els mateixos nivells de fosforilació que els del mutant simple mkk1.
Paral·lelament als nostres resultats i a fi d’aprofundir en el paper de la fosfatasa Ptc1 amb la via CWI, vam establir una col·laboració amb el grup de la Dra. María Molina de la Universidad Complutense de Madrid. Aquest grup va dur a terme diversos experiments similars als descrits en aquesta Tesi, com ara l’estudi de l’expressió de MLP1 fusionat a GFP per citometria de flux o l’estat de fosforilació de Slt2 dels mutants ptc1, mkk1 ptc1 i mkk2 ptc1, tant en condicions basals com en presència de vermell Congo, un agent que provoca dany a la paret cel·lular (Maria Molina i col·laboradors, comunicació personal). Els seus resultats, juntament amb els nostres, apunten a la MAPKK Mkk1 com una molt possible diana de la fosfatasa Ptc1.
El conjunt dels resultats reforça la idea que la MAPKK Mkk1 és més efectiva que Mkk2 en la senyalització de Slt2 (Martín et al. 2000). A més a més, la supressió de MKK1 però no la de MKK2 alleugera els fenotips de sensibilitat del mutant ptc1 enfront diverses condicions que provoquen dany a la paret cel·lular com CFW, cafeïna i pH. Aquestes dades encaixen amb la idea que la sensibilitat davant d’aquests compostos o estressos de les cèl·lules que els manca la fosfatasa Ptc1 es deu principalment a una hiperactivació de la via CWI sota aquestes condicions i permet explicar perquè es redueix, principalment, en absència de Mkk1. Això implicaria que qualsevol hiperactivació de la via provocaria sensibilitat enfront estressos que activin la via CWI. Un exemple és el cas presentat per Watanabe i col·laboradors, els quals van demostrar que la sobreexpressió d’una versió de MKK1 hiperfosforilada en una soca salvatge i en un mutant bck1 provoca sensibilitat d’aquestes cèl·lules a 35 ᵒC (Watanabe et al. 1995).