5. MATERIAL Y MÉTODOS
5.3 Modelo de úlcera por presión
Una vez establecido un modelo reproducible de injerto de piel humana sobre ratón, se ideó un mecanismo para crear una úlcera por presión sobre dicho injerto. Se decidió utilizar una pinza metálica, modificada para crear una superficie lisa en sus palas, entre las cuales comprimir la piel para originar la úlcera. Se llevó a cabo una evaluación y análisis en el Departamento de Materiales de la Escuela Técnica Superior de Ingenieros de Minas, Universidad Politécnica de Madrid, para determinar las características y presión ejercida de dicho dispositivo.
5.3.1 La pinza como elemento mecánico
La pinza es un útil que sirve habitualmente para sujetar tarjetas de identificación o control. Es del tipo de cocodrilo de mordedura única lineal frontal. Está modificada en sus dos mandíbulas para convertirla en una pinza de presión, deshaciendo los plegados originales de la mordedura lineal. Esta modificación original ha convertido la pinza en un instrumento generador de presión (Figura 2).
La presión de nuestro instrumento depende de tres factores:
a. La superficie de contacto de las dos mandíbulas modificadas, siendo la de la mandíbula
grande 48,4 mm2 y la de la pequeña 47.3 mm2 ± 0,1 mm.
b. La forma geométrica de la pinza, al ser una palanca de primer grado. La fuerza F es la
generada por el muelle y R es la fuerza que generará la presión de la pinza. R = 10/12 F = 0,833 F
P = R/S = 0,83 F / 47 = 0,017 F (N/mm2) = 150 F (mmHg)
c. La fuerza que genera el muelle. El muelle es helicoidal de torsión con extremos radiales, y
por lo tanto su fuerza será variable en función del ángulo de giro que generemos en el muelle desde su posición de reposo, su cálculo y diseño se recoge en la norma UNE-EN 13906-3.
Figura 2. Pinza de presión. a. Pinza metálica. b. Esquema representativo de la pinza como dispositivo que genera presión, siendo F la fuerza generada por el muelle y R la fuerza que generará la presión de la pinza.
5.3.2 Ciclos de isquemia - reperfusión
Se utilizaron 22 ratones con piel humana estable (tras 60 o más días desde la cirugía del injerto) para crear una úlcera por presión. Se produjo la úlcera mediante aplicación de ciclos repetidos de presión de 150 mmHg con la pinza descrita previamente. La duración de un ciclo completo fue de 24 horas. En cada ciclo se mantuvo la pinza durante 8 horas consecutivas, dejando las 16 horas restantes del día libre de compresión, de tal forma que la piel fue sometida a períodos
de isquemia seguidos de reperfusión.258 Al aplicar la pinza, todas las capas del injerto de piel
humana quedaron comprimidas entre las palas de la pinza.
Se aplicaron a cada ratón tres ciclos de compresión-liberación (duración total de 3 días), teniendo cuidado de colocar la pinza siempre en el centro y sobre el mismo lugar del injerto. Durante este periodo de 3 días, se administró a los ratones analgesia con meloxicam 1 mg/kg por vía subcutánea. Durante el tiempo que los ratones llevaron la pinza, se mantuvieron estabulados en sus jaulas, sin que ésta les causase alteraciones para la deambulación, alimentación, u otras (Figura 3).
Figura 3. Aplicación de la pinza sobre injerto de piel humana en ratón para generar una úlcera por presión. En la figura de la izquierda: detalle de la pinza colocada sobre la piel humana. En la figura de la derecha: ratón portador de pinza, estabulado con normalidad.
5.3.3 Análisis macroscópico
De los 22 ratones con úlcera por presión, 12 fueron destinados al análisis y evolución de las úlceras, y 10 al estudio de la cicatrización y aplicación de hormona de crecimiento (ver apartado 5.4). Seis ratones fueron sacrificados para toma de biopsias de la lesión completa (incluyendo piel humana sana de alrededor) mediante bisturí a los 5, 25, 45 y 130 días post-pinza. Los otros seis animales se usaron para valorar la evolución de la úlcera por presión mediante análisis fotográfico. Todos los animales fueron sacrificados tras un máximo de 190 días mediante administración de una atmósfera creciente de dióxido de carbono, realizándose resección completa mediante bisturí del injerto de piel humana para su estudio microscópico.
Macroscópicamente, la úlcera fue evaluada cada 7 días durante 130 días tras completar los 3 ciclos de compresión, con análisis visual y fotográfico. Se tuvieron en cuenta el tamaño de la úlcera y las características de la escara necrótica.
5.3.4 Análisis microscópico
Las biopsias obtenidas a los 5, 25, 45 y 130 días fueron fijadas por inmersión en tres soluciones diferentes: formaldehído tampón al 10%, Bouin y Carnoy. Posteriormente, una vez transcurridos los períodos de tiempo establecidos para la correcta fijación de las muestras, estas se deshidrataron y finalmente se incluyeron en parafina. Las piezas incluidas en parafina se cortaron con un microtomo rotatorio, obteniendo cortes seriados de 5 micras de espesor. Un total de 50 secciones tisulares por cada muestra, pasando a través del plano central de cada una de las biopsias, fueron colocadas en portaobjetos y posteriormente fijadas con hematoxilina-eosina y tricrómico de Masson para valoración morfológica (técnicas de tinción descritas en apartado 5.2). Se llevaron a cabo técnicas inmunohistoquímicas para las proteínas de matriz extracelular tropoelastina, LOX y LOXL-1, colágeno I, colágeno III, MMPs y fibrilina-1. Las muestras tisulares fueron desparafinadas, hidratadas y equilibradas en PBS (ph 7.4). Los siguientes anticuerpos fueron usados
como anticuerpos primarios: rabbit anti-tropoelastina, anti-LOX, anti-LOXL-1 (donado por Pascal
Sommer), anti-COL-I, anti-COL-III, anti-MMP-1, anti-MMP-2, anti-MMP-9 (Abcam, Cambridge, UK). Después las muestras fueron incubadas con el anticuerpo secundario anti-rabbit IgG (Sigma- Aldrich, St.Louis, Missouri, USA). Para tropoelastina, fibulina, LOX, LOXL-1 y MMPs, la
reacción antígeno-anticuerpo fue detectada con el procedimiento avidina-biotina marcado con peroxidasa. El sustrato cromogénico contenía DAB. Para colágeno I y III el procedimiento de fosfatasa alcalina fue realizado y el sustrato cromogénico contenía α-napthol y fast-red. Los núcleos
fueron contrastados con hematoxilina. Se realizó control negativo sin el anticuerpo primario. La
tinción inmunohistoquímica fue puntuada con la siguiente escala: 0-1 mínima tinción (0%-25%), 2 moderada (25-65%), 3-4 intensa (65%-100%).
Una vez preparadas las muestras, el análisis se realizó con microscopio óptico Zeiss Axiophot (Carl Zeiss Oberkochen, Germany). Se tomaron fotos mediante cámara AxioCam HRc (Carl Zeiss Oberkochen, Germany).
5.3.5 Análisis estadístico
Se utilizaron test no paramétricos para el análisis de los datos. Se comparó la expresión (intensidad de la tinción inmunohistoquímica) de tropoelastina, LOX, LOXL-1, colágeno I, colágeno III y fibrilina entre piel humana control, piel humana injertada en ratón NOD/Scid (ILPT) y ILPT después de la cicatrización de la UPP (ILPT-UPP). En el caso de que hubiera tres categorías se utilizó el test de Kruskal-Wallis. Cuando la variable presentaba sólo dos categorías se utilizó el test de la U de Mann Whitney. El análisis de los datos se realizó mediante el paquete estadístico SPSS versión 21 para Windows. P-valor < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.