Desde hace algunos años, los efectos biológicos asociados a la exposición a DBRI han sido el centro de atención de la radiobilogía. La teoría del Target planteada originalmente por Osborne y colaboradores en el año 2000, fue rápidamente desafiada por los efectos a largo plazo observados en este tipo de exposición. Dada la imposibilidad de separar estos efectos al estudiar la respuesta celular a la exposición crónica de DBRI, se planteó paralelamente al MIC un modelo en el cual las células fueron expuestas a la radiación sólo en el primer día del mismo. Así se intentará analizar el daño subyacente en el MIC originado exclusivamente por la primera exposición.
Análisis al inicio del MIG
Al igual que lo observado en el modelo de irradiación crónica, los resultados del EC con ambas metodologías de análisis y para ambas líneas celulares, han evidenciado un aumento estadísticamente significativo de daño en la hebra de ADN, inmediatamente después de la primera irradiación.
De igual manera, la frecuencia de MN también aumentó en forma significativa en ambas líneas celulares. Este resultado, junto con los obtenidos en el EC, manifiesta dos cuestiones importantes que han sido ya ampliamente detalladas en el análisis del MIC: el hecho de que una dosis tan baja como 100 mSv de rayos X haya sido capaz de propiciar daño en el ADN; y que este daño se corresponda, al menos en parte, con fracturas de cadena doble.
Estos resultados concuerdan con datos obtenidos por otros autores en diversas líneas celulares a través no sólo del EC y ensayo de MN, sino por medio de otras técnicas, como la identificación de focos de histonas o la electroforesis en gel de campo pulsante (Vijayalaxmi et al., 1993; Wojewodzka et al., 1998; Rothkamm y Löbrich, 2003, Güerci et al., 2004 y 2005; Sudprasert et al., 2006).
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Por su parte, los niveles de apoptosis analizados en ambas líneas celulares, a través de la técnica de Anexina V, no arrojaron diferencias entre las poblaciones celulares irradiadas con sus respectivos controles. Como se planteó en el MIC, cabe la posibilidad de que esto sea debido a que el análisis se realizó inmediatamente después de la irradiación, de modo que es probable que no haya transcurrido el tiempo suficiente para alcanzar el punto de eversión de la membrana plasmática, evento evidenciado a través de esta técnica.
Análisis al final del MIG
Cuando los ensayos se realizaron luego de transcurridos los diez días establecidos en este diseño experimental, los resultados mostraron niveles de daño en el ADN semejantes a los encontrados al inicio del protocolo para ambas líneas celulares. De modo contrario, la frecuencia de células vehiculizadas a apoptosis fue diferente entre una línea y otra, aunque en ninguno de los casos estas diferencias llegaron a alcanzar relevancia estadística. Por su parte, en la línea celular CHO-K1 se observó una disminución de este parámetro a lo largo del protocolo, mientras que en su línea derivada, XRS-5 se halló un incremento del mismo.
En primer lugar es importante resaltar que al igual que lo ocurrido en el modelo de exposición crónica, al comparar los cultivos utilizados como controles de ambas líneas celulares entre el primero y el último día del diseño, no se han encontrado diferencias estadísticamente significativas con ninguno de los ensayos utilizados. Esto es sumamente importante, ya que asegura la estabilidad de la línea pudiendo concluir finalmente que cualquier diferencia encontrada en las poblaciones celulares podría ser atribuible a la exposición a la radiación en el primer día del diseño experimental.
Al contrastar los resultados del EC para la línea celular CHO-K1 encontrados al final del protocolo con respecto a los correspondientes al inicio del mismo, luego de que la población fuera expuesta a 100 mSv de rayos X, no se ha observado ningún cambio significativo. Esta tendencia se evidenció tanto para el análisis cualitativo como cuantitativo.
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En esta misma línea celular la frecuencia de MN observada al finalizar el protocolo (D10 d100), resultó mayor respecto de su control en el último día pero menor respecto de la población analizada en el D1 luego de transcurrido un ciclo celular desde la exposición a la radiación (D1 d100). Si bien en ninguno de los dos casos las diferencias fueron significativas desde el punto de vista estadístico, estos resultados revelan un hecho de importancia biológica. Dado que las células de la línea CHO-K1 disponen de toda la maquinaría celular necesaria para reparar su material genético, los resultados observados con el EC y el ensayo CBMN permiten sugerir que el daño encontrado hacia el final del MIG sería un daño de novo en la hebra de ADN ocurrido a lo largo del protocolo.
Ahora bien, al contrastar los resultados obtenidos para el ensayo de Anexina V inmediatamente después de recibida la radiación (D1 d100), con los obtenidos luego de transcurridos los diez días del MIG (D10 d100), se observó una disminución no significativa en la frecuencia de las células vehiculizadas a apoptosis, manteniéndose en todos los casos dentro de niveles que podrían considerarse basales.
Este resultado, sumado a los obtenidos con el EC y el ensayo CBMN, sugiere que el daño en el ADN observado en el último día del MIG estaría relacionado con un desbalance generado por la radiación del día uno, que impide a las células reestablecer su fenotipo y comportamiento original. En este contexto, podría sugerirse un aumento general del estrés celular originado por concentraciones crecientes de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno. Shim y colaboradores en el año 2014, plantearon la idea de que el estrés oxidativo puede persistir durante mucho tiempo después de la exposición inicial en células de la progenie. Tratamientos antioxidantes, tales como la sobreexpresión de enzimas relacionadas con la respuesta celular a la presencia de especies reactivas de oxígeno, han demostrado efectividad para reducir los efectos asociados al estrés oxidativo a largo plazo (von Zglinicki, 2002, Serra et al., 2004).
Al analizar el comportamiento de las células XRS-5, se observó que los resultados encontrados a través del EC al final del MIG son semejantes a los encontrados para la línea celular CHO-K1. La comparación entre los resultados obtenidos el primero y el último día del diseño experimental para las células irradiadas
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con 100 mSv de rayos X muestra diferencias no significativas. Así, podría concluirse que los niveles de daño encontrados en el ADN una vez propiciada la injuria son los mismos desde el inicio hasta el final del diseño.
Si bien las células de la línea XRS-5 son deficientes para la proteína Ku80, estrechamente involucrada en la reparación del ADN por NHEJ, actualmente es vasta la bibliografía que sostiene la existencia de mecanismos de reparación alternativos, los cuales debieron haber permitido a las células recuperar su integridad genómica en este período.
Así, los resultados obtenidos para esta línea celular en este punto experimental refuerzan nuevamente la idea sugerida al analizar los resultados hallados en la línea CHO-K1, en donde se propuso la existencia de una daño de novo. Estas observaciones son coincidentes para los resultados obtenidos tanto con el EC y como a través del CBMN, encontrándose el mismo nivel de daño al inicio y al final del protocolo.
Los resultados obtenidos en el MIG por medio del análisis de Anexina V mostraron un comportamiento diferencial de la línea XRS-5 respecto del observado en la línea parental, ya que se observó un aumento en el número de células apoptóticas al final del protocolo. Este aumento no resultó estadísticamente significativo al contrastarlo con el análisis realizado post-irradiación, pero sí resultó significativo al contrastarlo con la población control en el D10. Una explicación posible para este resultado podría estar basada en el hecho de que la cinética de reparación de los mecanismos alternativos en células deficientes en NEHJ difiere de aquella que puede observarse en una línea celular sin compromiso de una de las principales vías de reparación del ADN. Consecuentemente, podría ocurrir que el daño de novo instaurado constantemente a lo largo del protocolo, sumado a una cinética de reparación más lenta que podría saturarse rápidamente, sean responsables del aumento de la apoptosis. Así, podría observarse como resultado un nivel de daño semejante al inicial, sólo porque aquellas células que hubieren aumentado considerablemente el nivel de daño en su ADN no estarían siendo incorporadas para este análisis, ya que podrían haber sido eliminadas del cultivo por apoptosis u otro mecanismo de muerte celular. En este sentido, los resultados serían semejantes a los encontrados en estudios llevados a
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cabo por Rothkamm y Löbrich en el año 2003 quienes simularon condiciones de incapacidad de reparación manteniendo los cultivos en confluencia durante todo el protocolo experimental.
Por último es importante resaltar que el hecho de encontrar células marcadas con Anexina V, en esta línea celular, pone de manifiesto que la ausencia de la proteína Ku80 no impediría en principio la vehiculización celular hacia una muerte programada.