XV.I- Diseño experimental: estudio del efecto antitumoral de la Fracción D sobre tumores establecidos.
Para la obtención de este modelo se utilizaron 14 ratones N:NIH(S)-
Fox1nu hembras vírgenes sanas de 9-10 semanas de edad y de 25 g de peso promedio. Estos animales fueron adquiridos en la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de La Plata, Argentina. Los animales se mantuvieron bajos condiciones controladas de temperatura y humedad, con ciclos diarios de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad y con libre disponibilidad de alimento y agua. El cuidado y la manipulación de los ratones se realizaron de acuerdo con los lineamientos institucionales de buenas prácticas de trabajo con animales de laboratorio.
A los 63-70 días de edad se inyectó cada ratón en forma subcutánea con 10 × 106 células MDA-MB-231 en 150 µL de medio RPMI libre de suero y antibiótico. De igual manera al experimental anterior, las células tumorales fueron implantadas a nivel de las glándulas mamarias inguinales, a fin de que el desarrollo tumoral tuviera el entorno más propicio. El implante de las células se llevo a cabo empleando jeringas de 1 mL con agujas hipodérmicas (BD) 0,80 x 25 mm (21Gx1).
En 13 de los 14 ratones la implantación tumoral fue posible. Sin embargo el comportamiento de los tumores no fue el esperado, ya que se desarrollaron como una masa muy dispersa cuyo tamaño oscilaba e incrementaba solo ligeramente con el paso del tiempo. Estas características del modelo dificultaron, en primera instancia, la decisión del momento de inicio del
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tratamiento. Establecido el comienzo, los animales fueron divididos aleatoriamente en 2 grupos: experimental (n=7) y control (n=6). Los ratones del grupo experimental fueron tratados con 21 mg/Kg de Fracción D de Maitake en 50 L de solución fisiológica. Cada ratón recibió 5 aplicaciones semanales durante 4 semanas y un día (21 dosis en total), administradas subcutáneamente en la periferia del tumor en desarrollo. Los ratones del grupo control fueron tratados con el vehículo de la Fracción D exactamente de la misma manera y durante el mismo tiempo. La dosis de Fracción D a inyectar en los animales se determinó en base a multiplicar por 10 a la IC50 resultante
de los ensayos de viabilidad realizados in vitro sobre la línea celular MDA-MB- 231 (IC50=1050 g/mL) (de Matos et al, 2012).
Antes de cada aplicación se midió con un calibre digital el diámetro mayor (A) y menor (B) del tumor, para estimar su volumen empleando la fórmula π/6 x A x B2 (se asume un forma elipsoidal; Geran et al, 1972). Así como también se registró el peso de cada ratón en estudio y su comportamiento.
Luego de 21 dosis recibidas, los animales fueron sacrificados por dislocación cervical según recomendaciones de la Guía de Buenas Prácticas con Animales de Experimentación. El punto final del ensayo fue condicionado por el estado de los tumores de los animales.
El tumor obtenido por disección de cada animal fue pesado, fotografiado y medido en sus tres dimensiones: diámetro mayor (A), diámetro menor (B) y profundidad (C), para calcular su volumen multiplicando las tres medidas. El tumor fue fijado en formol al 10 % en PBS 1 X por 24 h para su posterior análisis histológico.
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XVI.I- Diseño experimental: estudio del efecto antitumoral de la Fracción D sobre tumores establecidos.Para la obtención de este modelo se utilizaron 12 ratones BALB/c hembras vírgenes sanas de 9-10 semanas de edad y de 20 g de peso promedio. Estos animales fueron adquiridos en la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de La Plata, Argentina. Los animales se mantuvieron bajos condiciones controladas de temperatura y humedad, con ciclos diarios de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad y con libre disponibilidad de alimento y agua. El cuidado y la manipulación de los ratones se realizaron de acuerdo con los lineamientos institucionales de buenas prácticas de trabajo con animales de laboratorio.
A los 63-70 días de edad se inyectó cada ratón en forma subcutánea con 4 × 105 células LM3 en 100 µL de medio DMEM libre de suero y antibiótico. Se decidió implantar las células tumorales a nivel de las glándulas mamarias inguinales, a fin de que el desarrollo tumoral de las células LM3 tuviera el entorno más propicio. El implante de las células se llevo a cabo empleando jeringas de 1mL con agujas hipodérmicas (BD) 0,80 x 25 mm (21Gx1).
Cuando los tumores alcanzaron un tamaño medible con precisión (diámetro menor > 0,2 cm) los ratones fueron divididos en 2 grupos: experimental (n=5) y control (n=7). Los ratones del grupo experimental fueron tratados con 15,63 mg/Kg de Fracción D de Maitake en 50 L de solución fisiológica. Cada ratón recibió 5 aplicaciones semanales durante 4 semanas (20 dosis en total), administradas subcutáneamente en la periferia del tumor en desarrollo. Los ratones del grupo control fueron tratados con el vehículo de la Fracción D exactamente de la misma manera y durante el mismo tiempo. La dosis de Fracción D a inyectar en los animales se determinó en base a multiplicar por 10 a la IC50 resultante de los ensayos de viabilidad realizados in
vitro sobre la línea celular LM3 (IC50 = 570,6 g/mL) (de Matos et al, 2012)
Antes de cada aplicación se midió con un calibre digital el diámetro mayor (A) y menor (B) del tumor, para estimar su volumen empleando la
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fórmula π/6 x A x B2 (se asume un forma elipsoidal; Geran et al, 1972). Así como también se registró el peso de cada ratón en estudio y su comportamiento.
Luego de 20 dosis recibidas, los animales fueron sacrificados por dislocación cervical según recomendaciones de la Guía de Buenas Prácticas con Animales de Experimentación. El punto final del ensayo fue condicionado por el tamaño y estado de los tumores de los animales.
El tumor obtenido por disección de cada animal fue pesado, fotografiado y medido en sus tres dimensiones: diámetro mayor (A), diámetro menor (B) y profundidad (C), para calcular su volumen multiplicando las tres medidas. El tumor, hígado, bazo y riñones fueron fijados en formol al 10 % en PBS 1 X por 24 h para su posterior análisis histológico.
XVI.II- Diseño experimental: estudio del efecto preventivo de la Fracción D.
Para la obtención de este modelo se utilizaron 16 ratones Balb/c hembras vírgenes sanas de 6 semanas de edad y de 24 g de peso promedio. Estos animales fueron adquiridos en la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de La Plata, Argentina. Los animales se mantuvieron bajos condiciones controladas de temperatura y humedad, con ciclos diarios de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad y con libre disponibilidad de alimento y agua. El cuidado y la manipulación de los ratones se realizaron de acuerdo con los lineamientos institucionales de buenas prácticas de trabajo con animales de laboratorio.
Los ratones fueron divididos aleatoriamente en 3 grupos: 2 grupos experimentales (n=5 cada uno) y un grupo control (n=6). Los grupos experimentales fueron tratados con distintas dosis de Fracción D: 1,5 mg/Kg o 5 mg/Kg en 100 L de solución fisiológica. Cada ratón recibió 15 dosis diarias consecutivas, administradas intraperitonealmente. Los ratones del grupo control fueron tratados con solución fisiológica exactamente de la misma manera y durante el mismo tiempo. La dosis de Fracción D a inyectar en los
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animales se determinaron en base a literatura previa (Nanba, 1995; Inoue et al, 2002)
En el día 16, luego del tratamiento con la Fracción D de Maitake o control, se inyectó cada ratón en forma subcutánea con 4 × 105 células LM3 en 100 µL de medio DMEM libre de suero y antibiótico. De igual manera a los ensayos in vivo descriptos anteriormente, las células tumorales fueron implantadas a nivel de las glándulas mamarias inguinales. El implante de las células se llevo a cabo utilizando jeringas de 1 mL con agujas hipodérmicas (BD) 0,80 x 25 mm (21Gx1).
Por examinación visual y palpación de la zona abdominal-inguinal se detectó y registró el momento (día) de la aparición tumoral. Se consideró tumor a un bulto cuyo diámetro menor superara 0,2 cm. Una vez detectado el tumor, se midió con un calibre digital su diámetro mayor (A) y menor (B), para estimar el volumen tumoral empleando la fórmula π/6 x A x B2 (se asume un forma elipsoidal; Geran et al, 1972). También se registró el peso de cada ratón en estudio. Ambas mediciones se realizaron día por medio.
Luego de 30 días de la implantación de las células tumorales, los animales fueron sacrificados por dislocación cervical según recomendaciones de la Guía de Buenas Prácticas con Animales de Experimentación. El punto final del ensayo fue condicionado por el tamaño y estado de los tumores de los animales.