Modelos de ataxia de Friedreich en eucariotas pluricelulares

Los modelos de levadura y los cultivos celulares pueden presentar grandes limitaciones a la hora de extrapolar resultados por tratarse de modelos unicelulares y, en el caso de la levadura, por ser un organismo demasiado alejado evolutivamente del ser humano. Los modelos establecidos en el ratón son de enorme importancia no sólo para el estudio de la función de la frataxina sino también para el ensayo de posibles terapias.

El modelo de ratón knock-out presenta la deleción del exón 4 del gen frda, lo cual produce una ausencia total de frataxina. Los experimentos con este ratón sugirieron la idea de que la relación con el hierro podía ser un efecto secundario (Cossee et al., 2000), ya que los individuos morían en estadío embrionario pero sin observarse acumulaciones de hierro en la mitocondria. Para superar los problemas experimentales que esta letalidad embrionaria implicaba, se generaron dos tipos de mutantes condicionales. En uno de ellos, se reducía la expresión de la frataxina en el músculo esquelético y cardiaco, y en el otro en los tejidos neuronales y algunos no neuronales. En conjunto, ambas líneas mutantes reproducen muchos aspectos de la enfermedad humana, observados también con otros modelos, como la pérdida de ADN mitocondrial, la disminución de la concentración de hierro mitocondrial y las deficiencias en la actividad enzimática de la aconitasa y el complejo II de la cadena de transporte electrónico (Puccio et al., 2001; Santos et al., 2003;). Pero además, reproducen también otros aspectos cuyo estudio es imposible en los modelos de levadura o celulares, como la progresiva neurodeneración, la ataxia, la menor esperanza de vida, la pérdida selectiva de neuronas sensoriales, la hipertrofia cardiomiopática y la detección de procesos de apoptosis y autofagia en los tejidos más afectados (Simon et al., 2004).

Con la intención de establecer un entorno lo más parecido posible a los pacientes, se generó otro modelo de ratón en el que se habían introducido unas 230 repeticiones GAA en el gen frda (Miranda et al., 2002). En él no se consiguió una reducción de la expresión suficientemente elevada para producir una patología, por ello se obtuvo un individuo heterocigoto con las repeticiones en un cromosoma y el gen frda con el exón 4 delecionado en el otro. En este nuevo modelo, el descenso de la frataxina fue elevado pero aún compatible con un desarrollo embrionario normal. Además, no se observó ninguna alteración fisiológica, enzimática o de comportamiento, al menos durante el primer año de vida de los individuos. Tampoco se observó ningún defecto en los ratones en los que se sobreexpresó el gen frda (Miranda et al., 2004).

El modelo de ratón se ha empleado también para comprobar la eficacia de algún tratamiento como la idebenona. Este compuesto reduce, en el modelo murino, el daño oxidativo y estimula la función mitocondrial, pero sólo en el músculo cardiaco, sin aportar ninguna mejora al estado neurológico al igual que ocurre en los pacientes (Seznec et al., 2004a). Por último, se están ensayando, también en ratones, tratamientos basados en antioxidantes dirigidos específicamente a la mitocondria como la Mitoquinona y más recientemente la Mitovitamina E (revisado en Voncken et al., 2004).

Actualmente, se están desarrollando modelos en Arabidopsis Thaliana, C. elegans y D.

melanogaster. En el primero, se aisló el gen ortólogo en el cromosoma 4 del genoma de Arabidopsis. Este gen codifica para una proteína de 187 aminoácidos y un péptido señal

de localización mitocondrial y comparte una elevada homología con las frataxinas identificadas en otros organismos. Se ha observado una alta expresión de este gen en un órgano de gran demanda energética como son las flores (Busi et al., 2004).

En el segundo caso, el gen ortólogo denominado como frh-1, se enmarca en el seno del operón CEOP2232. El gen se expresa en el conjunto de neuronas sensitivas y de la cabeza, así como en el intestino, la faringe, las espermatecas y la glándula anal. La interferencia de ARN de este gen afecta a las neuronas sensitivas, a la puesta de huevos, al bombeo faríngeo y a la defecación (en Vázquez, 2003). Sin embargo, a diferencia de lo encontrado en los modelos establecidos hasta el momento, otros autores han observado que una disminución importante de la frataxina confiere a los gusanos resistencia frente al estrés oxidativo y aumenta su tiempo de vida en un 25% de modo similar a otras mutaciones mitocondriales en este organismo (Ventura et al., 2005). Finalmente, en Drosophila se ha aislado el gen fh, ortólogo al gen FRDA humano. Es un gen que se localiza en el cromosoma X, con un tamaño de aproximadamente 1kb y que consta de dos exones separados por un pequeño intrón. Codifica para una proteína de 190 aminoácidos que incluye el péptido señal de importación a mitocondria, y que presenta una alta homología, a nivel de estructura primaria y secundaria, con la frataxina humana y el resto de proteínas frataxina. El gen se expresa a lo largo de todo el desarrollo de Drosophila y presenta un patrón ubicuo de expresión embrionaria (Cañizares et al., 2000).

Esta Tesis Doctoral forma parte de un Proyecto más amplio consistente en desarrollar en Drosophila, un modelo de estudio de la ataxia de Friedreich, enfermedad neurodegenerativa humana causada por la pérdida de función del gen

FRDA.

El objetivo central de este trabajo ha sido la obtención de fenotipos mutantes del gen frataxin homologue de D. melanogaster (fh), que nos permitieran el estudio de su función. Para ello se abordaron los siguientes objetivos específicos:

9 Generación de mutantes estructurales del gen fh mediante movilización de elementos transponibles P.

9 Generación de mutantes funcionales transitorios del gen fh mediante la interferencia de ARN de doble cadena y el sistema UAS-GAL4

9 Análisis de la sobreexpresión del gen fh en distintos tejidos y/o momentos del desarrollo de Drosophila.