MARTINA HUDCOVICOVÁ, DANIEL MIHÁLIK, SVETLANA ŠLIKOVÁ, VALÉRIA ŠUDYOVÁ Centrum výskumu rastlinnej výroby Piešťany
Tobamoviruses cause heavy yield losses for tomato and pepper worldwide. The detection of these viruses is becoming an important area in the plant pathology research. In our study we successfully used DAS-ELISA method for detection of TMV and ToMV in leaves of pepper and tomato. TMV was detected in 3 pepper samples and in 3 tomato samples inoculated in Zelseed and in all 4 pepper samples inoculated in CVRV. ToMV was detected in 14 tomato samples inoculated in Zelseed and in 3 tomato samples inoculated in CVRV. TMV and ToMV were not detected in non-inoculated tomato and pepper samples provided by Zelseed.
Key words: tobamoviruses, TMV, ToMV, pepper, tomato, ELISA
ÚVOD
Podiel pestovanej plodovej zeleniny na Slovensku tvorí 39% celkovej produkcie pestovanej zeleniny (Štatistický úrad SR, 2006). Paprika ročná (Capsicum annuum L.) a rajčiak jedlý (Solanum lycopersicum L.) patria z hľadiska agrotechniky a hospodárskeho významu ku strategickým zeleninám na Slovensku aj inde vo svete. Prostredie, v ktorom rastliny žijú je charakterizované určitými vonkajšími podmienkami, ktoré sú pre ich rast, vývoj a rozmnožovanie priaznivé, alebo nepriaznivé. Nepriaznivý vplyv vonkajšieho prostredia môže spomaľovať životné funkcie rastlín, poškodzovať ich jednotlivé orgány, čo v krajnom prípade vedie k odumretiu rastliny. Jedným veľmi dôležitým faktorom ovplyvňujúcim životné pochody papríky a rajčiaka je napadnutie vírusmi rodu Tobamovirus.
Tobamovírusy patria medzi najrozšírenejšie vírusy na celom svete. Vyznačujú sa mimoriadne vysokou infekčnosťou a odolnosťou voči vonkajším vplyvom. Napadajú všetky druhy čeľade Solanaceae. Príznaky ochorenia sa začínajú prejavovať zosvetlením žíl listov. Neskôr sa vytvárajú žlté škvrny na listovej čepeli, takže listy nadobúdajú žlté zafarbenie. Intenzita žltnutia listov varíruje od bledej až po citrónovú farbu. Typickými symptómami ochorenia sú mozaiky, u ktorých sa striedajú zelené, žlté a chlorotické oblasti, ktoré sa zafarbujú dohneda a nastáva nekróza. Napadnuté rastliny zaostávajú v raste, sú slabšie olistené, deformujú sa. Kvety vytvorené počas chlorotického štádia z väčšej časti opadávajú. Vytvorené plody sa vyvíjajú pomalšie, deformujú sa. Rastliny postupne odumierajú.
Ochorenia spôsobené tobamovírusmi zapríčiňujú závažné ekonomické straty v pestovaní papriky ročnej a rajčiaka jedlého najmä znižovaním ich úrody a kvality. Preto je veľmi dôležitá skorá, rýchla a presná diagnostika tohto ochorenia pomocou spoľahlivých metód. Cieľom našej práce je využitie sérologickej metódy DAS-ELISA (double antibody sandwich - enzyme-linked immunosorbent assay) a v ďalšej fáze práce využitie metódy RT- PCR (reverse transcription PCR) na spoľahlivú detekciu vírusov TMV (z angl. tobacco mosaic virus) a ToMV (z angl. tomato mosaic virus) v rastlinách papriky ročnej a rajčiaka jedlého.
MATERIÁL A METÓDY
Na DAS-ELISA analýzy sme použili súbor 40 genotypov papriky umelo infikovaných vírusom TMV (P1- P40) a súbor 40 genotypov rajčiaka umelo infikovaných vírusom ToMV (R1-R40). Oba súbory nám poskytla firma Zelseed, s.r.o., pričom 4 týždne po umelej infekcii boli z rastlín odobrané čerstvé listy. Listové vzorky boli odobrané aj zo súboru neinfikovaných 20 genotypov papriky (P41-P60) a 20 genotypov rajčiaka (R41-R60), taktiež poskytnuté firmou Zelseed, s.r.o.. Analyzovali sme aj listy 4 rastlín papriky a 4 rastlín rajčiaka z CVRV Piešťany (VÚRV Piešťany), a to 4 týždne po umelej infekcii vírusmi TMV resp. ToMV. Zo všetkých rastlín bolo odobrané po 0,1 g čerstvých listov a listy boli po odbere homogenizované pomocou tekutého dusíka. Homogenizovaný rastlinný materiál bol inkubovaný za občasného vortexovania v 2 ml extrakčného pufru po dobu 3 h na ľade, nasledovala centrifugácia 5 minút pri 10000 rpm a 4°C. Supernatant bol použitý na analýzy podľa pracovného postupu ELISA kitov firmy Bioreba na detekciu prítomnosti vírusov TMV a ToMV.
Špecifické rastlinné protilátky (IgG) sme 1000x zriedili v nanášacom pufri a pridali 200 μl do každej bunky ELISA platničky. Platničku sme tesne prekryli a vložili ju do vlhkého boxu. Nasledovala ikubácia pri 4°C cez noc, počas ktorej došlo k adsorpcii špecifických protilátok na povrch mikrotitračných buniek. Po vyprázdnení buniek sme bunky premyli 3-4 krát premývacím pufrom, odstránili sme všetku tekutinu vysušením platničky na obrúsky. Do buniek sme pridali po 200 μl z extraktu z každej vzorky – všetky vzorky boli nanášané v dvoch opakovaniach. Ako kontroly sme použili kontrolu pozitívnu a negatívnu dodané výrobcom. Pozitívnu kontrolu sme použili neriedenú a riedenú 1:10, 1:100 a 1:1000. Platničku sme tesne prekryli a vložili ju do vlhkého boxu. Nasledovala inkubácia pri 4°C cez noc, počas ktorej došlo k naviazaniu antigénu vírusu na rastlinné protilátky.
117
Platničku sme premyli postupom uvedeným vyššie. Enzýmový konjugát sme 1000x zriedili v kojugačnom pufri a pridali po 200 μl do bunky. Platničku sme tesne prekryli a vložili ju do vlhkého boxu. Nasledovala inkubácia pri 30°C 5 hodín, počas ktorej došlo k spájaniu - naviazaniu enzýmom označených protilátok. Platničku sme premyli postupom uvedeným vyššie. Substrát p-nitrofenyl fosfát sme rozpustili v substrátovom pufri (1 mg/ml) a pridali po 200 μl do bunky. Nasledovala inkubácia pri izbovej teplote (18-25°C) v tme. Po 30-120 minútach sme sledovali reakciu - farebná reakcia indikuje infikované vzorky. Vznik žltého sfarbenia sme hodnotili fotometricky pri 405 nm.
VÝSLEDKY A DISKUSIA
Sérologická metóda ELISA bola do rastlinnej virológie uvedená už v 70-tych rokoch (Clark a Adams, 1977) a stala sa široko využívanou metódou na detekciu a identifikáciu rastlinných vírusov vrátane tobamovírusov (Sevik a Kose-Tohumcu, 2011 a iní). Výhodou tejto metódy je jej jednoduchosť, nízke náklady, možnosť testovania veľkého počtu vzoriek a čiastočná automatizácia (Morrison, 1999). Nevýhodou metódy ELISA je možnosť krížovej reakcie medzi jednotlivými tobamovírusmi a ich antisérami, ako aj nižšia citlivosť a presnosť. Preto sa nedávno na detekciu tobamovírusov začali používať aj moderné molekulárne metódy ako sú RT-PCR (Da Silva a kol., 2008), Multiplex RT-PCR (Kumar a kol., 2011), RT-LAMP (Yanhua a kol., 2010) a iné, ktorých výhodou je vysoká špecificita, presnosť a citlivosť, nevýhodou je často finančná náročnosť a komplikovanejší postup.
Tabuľka 1: Priemerné hodnoty absorbancie pri vzorkách: nc negatívna kontrola, s1 – s4 pozitívna kontrola (riedenia 1:1000, 1:100, 1:10 a neriedená), R1-R40 a P1-P40 infikovaný rajčiak a paprika (Zelseed, s.ro.), R41- R60 a P41-P60 neinfikovaný rajčiak a paprika (Zelseed, s.r.o.), R61-R64 a P61-P64 infikovaný rajčiak a paprika (CVRV).
TMV ToMV TMV ToMV TMV ToMV TMV ToMV nc 0,0010 0,0030 R30 0,0010 0,0010 P24 0,0010 0,0015 R58 0,0010 0,0018 s1 0,0025 0,0095 R31 0,0010 0,0024 P25 0,0014 0,0010 R59 0,0010 0,0010 s2 0,0670 0,2230 R32 0,0010 0,0011 P26 0,0010 0,0010 R60 0,0018 0,0010 s3 0,3620 1,1865 R33 0,0018 0,0027 P27 0,0010 0,0014 P41 0,0010 0,0010 s4 0,4610 1,4280 R34 0,0010 0,0000 P28 0,0010 0,0010 P42 0,0010 0,0027 R1 0,0012 0,2730 R35 0,0010 0,0014 P29 0,0010 0,0021 P43 0,0010 0,0016 R2 0,0014 0,0470 R36 0,0010 0,0010 P30 0,0010 0,0010 P44 0,0012 0,0014 R3 0,0010 0,0010 R37 0,0012 0,0170 P31 0,0240 0,0010 P45 0,0010 0,0010 R4 0,0010 0,0023 R38 0,0010 0,0010 P32 0,0010 0,0010 P46 0,0010 0,0010 R5 0,0010 0,0010 R39 0,0010 0,0018 P33 0,0010 0,0010 P47 0,0013 0,0010 R6 0,0010 0,0010 R40 0,0010 0,0021 P34 0,0010 0,0027 P48 0,0010 0,0043 R7 0,0010 0,0012 P1 0,0010 0,0021 P35 0,0010 0,0016 P49 0,0010 0,0010 R8 0,0013 0,0380 P2 0,0010 0,0010 P36 0,0010 0,0010 P50 0,0010 0,0018 R9 0,0010 0,0010 P3 0,0010 0,0015 P37 0,0014 0,0010 P51 0,0014 0,0023 R10 0,0012 0,0580 P4 0,0010 0,0020 P38 0,0010 0,0018 P52 0,0014 0,0010 R11 0,0510 0,3250 P5 0,0640 0,0010 P39 0,0190 0,0010 P53 0,0010 0,0028 R12 0,0320 0,2140 P6 0,0010 0,0010 P40 0,0010 0,0010 P54 0,0015 0,0010 R13 0,0019 0,1440 P7 0,0010 0,0010 R41 0,0010 0,0023 P55 0,0012 0,0021 R14 0,0015 0,0800 P8 0,0010 0,0010 R42 0,0010 0,0010 P56 0,0010 0,0021 R15 0,0010 0,0010 P9 0,0010 0,0010 R43 0,0013 0,0010 P57 0,0013 0,0010 R16 0,0010 0,0010 P10 0,0010 0,0014 R44 0,0010 0,0010 P58 0,0015 0,0010 R17 0,0018 0,0043 P11 0,0010 0,0010 R45 0,0010 0,0010 P59 0,0010 0,0010 R18 0,0011 0,0010 P12 0,0010 0,0020 R46 0,0010 0,0014 P60 0,0010 0,0010 R19 0,0014 0,0320 P13 0,0013 0,0011 R47 0,0014 0,0010 R61 0,002 R20 0,0010 0,0010 P14 0,0015 0,0010 R48 0,0010 0,0021 R62 0,117 R21 0,0015 0,0920 P15 0,0010 0,0018 R49 0,0010 0,0010 R63 0,013 R22 0,0012 0,0010 P16 0,0010 0,0023 R50 0,0013 0,0010 R64 0,237 R23 0,0010 0,0010 P17 0,0011 0,0010 R51 0,0010 0,0021 P61 0,058 R24 0,0010 0,0210 P18 0,0010 0,0028 R52 0,0018 0,0010 P62 0,014 R25 0,0010 0,0470 P19 0,0010 0,0010 R53 0,0010 0,0010 P63 0,045 R26 0,0010 0,0010 P20 0,0010 0,0010 R54 0,0010 0,0010 P64 0,006 R27 0,0230 0,0080 P21 0,0010 0,0010 R55 0,0010 0,0014 R28 0,0010 0,0010 P22 0,0010 0,0010 R56 0,0016 0,0010 R29 0,0010 0,0010 P23 0,0011 0,0010 R57 0,0011 0,0020
Výsledky našich analýz pomocou metódy DAS-ELISA (Tab. 1 – pozitívne vzorky sú zvýraznené) potvrdili prítomnosť vírusu TMV v troch vzorkách listov infikovanej papriky ročnej a v troch vzorkách infikovaného rajčiaka jedlého z firmy Zelseed, s.r.o. a vo všetkých štyroch vzorkách listov papriky ročnej infikovanej na
118
VÚRV Piešťany. Prítomnosť vírusu ToMV bola zistená v štrnástich vzorkách listov infikovaného rajčiaka z firmy Zelssed, s.r.o. a v troch vzorkách listov rajčiaka infikovaného na CVRV Piešťany (VÚRV Piešťany). Tri vzorky infikovaného rajčiaka (R11,R12 a R27) boli pozitívne na oba vírusy, bola teda zistená krížová reakcia, ktorej možnosť uvádza aj výrobca ELISA kitov. Krížovej reakcii možno predísť použitím monoklonálnej protilátky proti vírusu (Vinayarani a kol., 2011). V súbore 20 neinfikovaných paprík a 20 neinfikovaných rajčiakov nebola prítomnosť vírusov pomocou DAS-ELISA metódy zistená.
Neriedené pozitívne kontroly vykazovali priemernú absorbanciu 0.461 pri TMV a 1,428 pri ToMV, negatívne kontroly mali priemernú absorbanciu 0,001 pri TMV a 0,003 pri ToMV. Ako pozitívne boli hodnotené vzorky s priemernou absorbanciou vyššou ako 2-násobok priemernej absorbancie negatívnej kontroly (podľa Svoboda a kol., 2006) – pri TMV vyššou ako 0,002 a pri ToMV vyššou ako 0,006. Priemerná absorbancia vzoriek pozitívnych na TMV sa pohybovala v rozmedzí 0,006-0,064 a priemerná absorbancia vzoriek pozitívnych na ToMV sa pohybovala v rozmedzí 0,008-0,325, čo je porovnateľné s výsledkami iných autorov (napr. Vinayarani a kol., 2011; Sevik a Kose-Tohumcu, 2011). Bolo dokázané, že hodnoty absorbancie získané ELISou sú ovplyvňované rastovou fázou rastlín, počas ktorej sú vzorky odoberané (Cordoba-Selles a kol., 2007) a v ďalšom pokuse by sme chceli otestovať prítomnosť vírusov v rôznych časových intervaloch od umelej infekcie. V ďalšej fáze našej práce sa budeme snažiť o špecifickejšiu a citlivejšiu detekciu vírusov TMV a ToMV prostredníctvom genomickej analýzy, ktorá si vyžaduje identifikáciu vírusov na úrovni nukleových kyselín a to pomocou metódy RT-PCR.
ZÁVER
V práci sme dokázali vhodnosť DAS-ELISA metódy na diagnostiku vírusov TMV a ToMV v listoch papriky ročnej a rajčiaka jedlého. Stanovovanie vírusových ochorení pri zelenine je nevyhnutnosťou na určenie bezviróznych materiálov v šľachtiteľskom procese. Podľa platných smerníc EÚ je nevyhnutná realizácia takýchto stanovení, zavedením týchto metodík sa zvyšuje konkurencieschopnosť slovenských šľachtiteľov aj v medzinárodnom meradle.
Poďakovanie: Tato štúdia vznikla vďaka podpore v rámci Operačného programu Výskum a vývoj pre projekt: Prenos efektívnych postupov selekcie a identifikácie rastlín do šľachtenia (ITMS: 26220220142), spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.
LITERATÚRA
CLARK, M. F. - ADAMS, A. N. 1977. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol., 34, 1977, s. 475-483.
CODOBA-SELLES, M. C. –GARCIA-RANDEZ, A. – ALFARO-FERNANDEZ, A. 2007. Seed transmission od Pepino mosaic virus and efficacy of tomato seed disinfection treatments. Plant Disease, 91, 2007, s. 1250- 1254.
DA SILVA, R. M. – DE SOUTO, E. R. – PEDROSO, J. C. – ARAKAVA, R. – ALMEIDA, A. M. R. – BARBOZA, A. A. L. – VIDA, J. B. 2008. Detection and identification of TMV infecting tomato under protected cultivation in Paraná state. Braz. Arch. Biol. technol., 51, 5, 2008, s. 903-909.
KUMAR, S. – UDAYA SHANKAR, A. C. – NAYAKA, S. C. – LUND, O. S. – PRAKASH, H. S. 2011. Detection of Tobacco mosaic virus and Tomato mosaic virus in pepper and tomato by multiplex RT-PCR. Letters in Applied Microbiology, 53, 2011, s. 359-363.
MORRISON, R. H. 1999. Sampling in seed health testing. Phytopathology, 89, 1999, s. 1084-1087.
SEVIK, M. A. – KOSE-TOHUMCU, E. 2011. The ELISA analysis results in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) seed health testing for Tobacco mosaic virus. Žemdirbyste - Agriculture, 98, 3, 2011, s. 301-306. SVOBODA, J. – ČERVENA, G. – RODOVA, J. 2006. First report of Pepper mild mottle virus in pepper seeds
produced in the czech Republic. Plant Protection Science, 42, 2006, s 34-37.
VINAYARANI, G. – MADHUSUDHAN, K. N. – DEEPAK, S. A. – NIRANJANA, S. R. – PRAKASH, H. S. 2011. Detection of mixed infection of Tobamoviruses in tomato and bell pepper by using RT-PCR and duplex RT-PCR. Int. J. Plant Pathol., 2 (2), 2011, s. 89-95.
YANHUA, L. – ZHIDE, W. – YUMEI, Q. – JIANMIN, M. – LILI, S. – FENGLONG, W. – JINGUANG, Y. 2010. Rapid detection of tobacco mosaic virus using the reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method. Arch. Virol., 155, 2010, s. 1681-1685.
Autori: Mgr. Martina Hudcovicová, PhD.*, Mgr. Daniel Mihálik, PhD., Ing Svetlana Šliková, PhD.
Výskumnýústav rastlinnej výroby Piešťany, Centrum výskumu rastlinnej výroby Piešťany, Bratislavská cesta 122, 921 68 Piešťany, SR
*Corresponding author: Tel.: +421-33-7722311; fax: +421-33-7726306; E-mail: [email protected]
119